WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаФізика → Озонна діра над Арктикою. - Реферат

Озонна діра над Арктикою. - Реферат

цитоскелетні структури кіллерної клітки певним чином перегрупуються.
Переорієнтація цитоскелету і рух стопок апарата Гольджі і гранул відбувається тільки після зв'язування лімфоцита з мішенню. Р. Тсен з Каліфорнійського університету в Берклі показав, що зв'язування викликає швидке і значне збільшення концентрації іонів кальцію усередині лімфоцита; це у свою чергу активує екзоцитоз. Дж. Янеллі й У. Енгельгард з Віргінського університету вдалося провести мікрокінозйомку переорієнтації гранул у цитоплазмі і їхнього злиття з плазматичною мембраною.
Усі ці дані дозволили думати, що у відповідь на контакт із кліткою-мішенню секреторний апарат кілерної клітки направляється на жертву і летального агента, що міститься в гранулах, "вистрілюється" у неї. Щоб перевірити цю гіпотезу, необхідно було довести, що гранули дійсно виконують ту ж функцію, що і зарядні шухляди в артилерії, а потім з'ясувати, що ж являють собою самі снаряди.
Першою задачею було виділити гранули і подивитися, чи можуть вони самі по собі убивати клітки. Це було зроблено в 1984 р. Хенкартом і Подаком і незалежно нашою групою. Ми застосовували різні методи фракціонування внутрішньоклітинних структур. У результаті таких експериментів вдається, зруйнувавши клітку на складові частини, визначити, у якій з них міститься той чи інший фермент чи зосереджена та чи інша функція. Кілернілімфоцити піддавали впливу азоту під високим тиском, що приводило до їх руйнування. Суспензію зруйнованих кліток наносили на градієнт щільності, створений інертними частками, і потім обертали у високошвидкісній центрифузі. Під дією відцентрової сили різні органелли переміщалися до дна пробірки і, потрапляючи в область із щільністю, рівної своїй власній, зупинялися. У результаті всі органелли розподілялися уздовж центрифужної пробірки у виді дискретних смуг. Кожну фракцію градієнта потім досліджували за допомогою електронного мікроскопа, визначали її ферментативну активність і здатність убивати клітки.
Одна з фракцій за даними електронної мікроскопії складалася майже винятково з гранул, містила визначений набір ферментів і, головне, могла убивати клітки: коли ізольовані гранули змішували з еритроцитами чи пухлинними клітками в середовищі, що містить іони кальцію, клітки гинули через кілька хвилин. На електронних мікрофотографіях було видно, що поверхня цих кліток містила кільцеподібні структури, не відмінні від тих, котрі формуються в мембрані клітки-мішені під дією живих кілерних кліток. У такий спосіб ми показали, що гранули кілерних кліток дійсно містять той летальний агент, за допомогою якого ці клітки убивають.
Незабаром був ідентифікований сам цей агент. У 1985 р. у співробітництві з Подаком і Г. Хенгартнером з лікарні Цюрихського університету ми знайшли білок, що у присутності іонів кальцію викликала такі ж ушкодження клітинної мембрани, як і живі кілерні клітки чи виділені з них гранули. Цей білок ми одержали в чистому виді, пропустивши екстракт гранул через хроматографічні стовпчики (де білки розділялися в залежності від електричного заряду і молекулярної маси) і перевіривши кожну фракцію на здатність викликати лізис еритроцитів, тобто ушкодження зовнішньої мембрани, у результаті якого клітки набухають і лопаються. Незалежно білок-"убивцю" виділили Д. Мессоні і Ю. Чопп з Університету в Лозанні. За здатність утворювати пори він названий перфоріном.
До цього часу в гранулах цитотоксичних Т-лімфоцитів і NK-кліток виявлений тільки один утворюючий пори білок - цей самий перфорін. Його молекулярна маса 70 тис. дальтонів. Якщо клітки інкубують з перфоріном у присутності іонів кальцію, вони через кілька хвилин лізуються. Однак якщо іони кальцію додати до перфоріну до того, як він зв'яжеться з клітками, то білок зовсім не виявляє свою лізуючу здатність. Цей парадоксальний на перший погляд факт багато чого проясняє в механізмі дії перфоріна на клітки.
Кілерна клітка виділяє молекули перфоріна, і ці молекули вбудовуються в мембрану клітки-мішені. Там вони полімеризуються, тобто з'єднуються один з одним. Полімеризація відбувається тільки в присутності іонів кальцію. Полімер, що утвориться, може приймати різні конфігурації, але в оптимальних умовах кінцевий продукт полімеризації має форму циліндра. При електронній мікроскопії він виглядає як кільце, якщо орієнтований уздовж пучка електронів, і як дві рівнобіжних лінії - якщо поперек. Внутрішній діаметр циліндра, за даними Подака і Деннерта, варіює від 5 до 20 нм.
Щоб перфорін зашкодив клітку-мішень, його полімеризація повинна відбуватися усередині мембрани, тому що впровадитися в мембрану можуть тільки мономери перфоріну. Якщо полімеризація відбудеться в розчині, то полімер не зможе проникнути потім у мембрану й убити клітку. Зміст цього зрозумілий: виявившись у позаклітинному просторі чи кровотоці, де в надлишку мається кальцій, перфорін швидко полімеризуеться і стає неактивним, що виключає можливість випадкового ушкодження інших, нормальних кліток організму.
Утворення в клітинній мембрані пір у результаті полімеризації перфоріну приводить до швидкого і легко помітного стану клітки. Зовнішня мембрана живої клітки утримує усередині її білки й інші великі молекули (за винятком тих, котрі повинні секретуватись). Крім того, вона забезпечує поділ іонів, так що одні з них концентруються усередині клітки, а інші залишаються ззовні. Унаслідок нерівномірного розподілу позитивно і негативно заряджених іонів існує мембранний електричний потенціал: внутрішній вміст клітки має негативний заряд стосовно позаклітинного середовища. Коли цілісність мембрани порушується, іони і вода перерозподіляються у відповідності зі своїми електрохімічними градієнтами, прагнучи до рівноваги, і мембранний потенціал зникає. Якщо дірки невеликі по розмірах, то виникає так називаний ефект Доннана: великі молекули не можуть вийти з клітки, тому що дірки для них малі, а вода і солі з навколишнього розчину проникають через мембрану усередину. В результаті клітка набухає і зрештою лопається.
За допомогою введених у клітку-мішень мікроелектродів нам вдалося зареєструвати значне падіння мембранного потенціалу незабаром після додавання перфоріну. Чуттєве електронне устаткування дозволило навіть вимірити потік іонів, що проходить через індивідуальну пору. Отримані результати погоджувалися з пророкуваннями теорії ефекту Доннана. Наші дані, крім того, свідчили, що утворені перфоріном пори - це стабільні структури і внутрішній канал пори постійно відкритий. Встановивши, які іони і молекули проходять через ушкоджену перфоріном мембрану, ми оцінили внутрішній діаметр пори. Він виявився в межах 1 - 10 нм, що трохи менше, ніж випливало з електронних мікрофотографій (5 - 20 нм).
Loading...

 
 

Цікаве