WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Роль індукції цитохрому Р-450 2е1 в патогенезі гепатотоксичності ізоніазиду (автореферат) - Реферат

Роль індукції цитохрому Р-450 2е1 в патогенезі гепатотоксичності ізоніазиду (автореферат) - Реферат

В роботі використано: субстанцію ізоніазиду виробництва ЗАТ Фармацевтична фірма "Дарниця" (Україна), рифампіцин виробництва фармацевтичного заводу "POLFA"А.О. (Польща), дисульфірам фірми Sigma (Німеччина), піридоксину гідрохлорид, метіонін та композицію "МВ" надано АТ "Київський вітамінний завод".

Експериментальні моделі ураження печінки, використані в дослідженні, представлено в табл. 1. Для моделювання експериментального медикаментозного гепатиту щурам внутрішньоочеревинно вводили ізоніазид у дозі 100 мг/кг маси тіла [С.М. Дроговоз, Ю.І. Губський, 2001] або ізоніазид у дозі 50 мг/кг та рифампіцин у дозі 86 мг/кг маси тіла щурам - внутрішньошлунково, виходячи з дозових рівнів при їх застосуванні в клініці [В.М. Петренко, 2002]. Дисульфірам, інгібітор CYP 2E1, вводили у дозі 30 мг/кг, виходячи з дози його застосування в клініці при алкоголізмі [C. Dollery, 1999]. Композицію "МВ" вводили щурам внутрішньошлунково у дозі 50 мг/кг маси тіла. У якості препаратів порівняння використовували антидот ізоніазиду піридоксин [M. Sievers, L. Chin, 1992] та метіонін, що є одним з основних складників композиції "МВ". Піридоксину гідрохлорид і метіонін щурам вводили внутрішньошлунково у дозах 5 мг/кг та 60 мг/кг маси тіла, відповідно. Дози препаратів порівняння та компонентів експериментальної композиції "МВ" (метіонін, б-токоферол, піридоксин, нікотинамід, фолієва кислота, тіамін, цианкобаламін, цинку сульфат) розраховували, виходячи з добових доз, що застосовуються в медичній практиці [Ф.П. Тринус, 1994]. Всі вищезазначені дози досліджуваних засобів було обчислено з урахуванням коефіцієнту видової чутливості [Ю.Р. Рыболовлев, Р.С. Рыболовлев, 1979]. Експериментальний алкоголізм моделювали згідно Ю.В. Бурова та Н.Н. Вередникова [1985]. Щурам контрольної групи вводили 0,9 % розчин NaCl, шлях введення – відповідно до експериментальної моделі.

Через 24 год. після останнього введення досліджуваних засобів у тварин під легким наркозом діетиловим ефіром відбирали кров зі стегнової вени та піддавали евтаназії шляхом цервікальної дислокації. Печінку відмивали через воротну вену 0,15 М розчином КСl, виділяли мікросомну фракцію печінки за методом S.A. Kamath та F.A. Kummerow [1971]. Постмітохондріальну фракцію печінки щурів отримували за методом І.І. Карузіної та А.І. Арчакова [1977]. Усі процедури виконували з дотриманням холодового режиму ( +4 0С).

Стан монооксигеназної системи печінки оцінювали за вмістом цитохромів Р-450 та b5 [T. Omura, R. Sato, 1964], n-нітрофенолгідроксилазною [D.R. Koop, 1990] та анілін-N-гідроксилазною [И.И. Карузина, А.И. Арчаков, 1977] активністю в мікросомній або постмітохондріальній фракціях печінки.

В мікросомній або постмітохондріальній фракціях печінки досліджували швидкість НАДФН- та аскорбат-залежного утворення продуктів реакції з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) [И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977]. В гомогенаті печінки визначали вміст білкових та небілкових (глутатіон) SH-груп [J. Sedlak, R. Lindsay, 1968].

У гомогенаті, постмітохондріальній фракції та фракції мікросом печінки визначали вміст білку [O.H. Lowry, N.J. Rosebrough et al., 1951].

Активність аланін- (АлАТ), аспартатамінотрансферази (АсАТ), лужної фосфатази (ЛФ), вміст загального білірубіну в сироватці крові визначали за допомогою біотестів виробництва НПП "Филисит-Диагностика" (Україна) та фірми PLIVA – Lachema a.s. (Чехія).

Обчислювали відносну масу печінки. Для гістологічного вивчення зрізи печінки забарвлювали гематоксиліном і еозином за методикою М.Г. Шубича [1965]. Аналіз препаратів здійснювали за допомогою мікроскопа Leica, (Німеччина).

Таблиця 1

Експериментальні моделі індукції та інгібування цитохрому Р-450 2Е1 у щурів

Експериментальні моделі

Досліджуваний засіб

Референтні засоби

Дисульфірам, 30 мг/кг, внутрішньошлунково + ізоніазид, 100 мг/кг, внутрішньоочеревинно, через 3 години після

введення дисульфіраму, 14 днів.

-

-

Ізоніазид, 50 мг/кг, внутрішньочеревинно, раз на добу, 28 днів.

композиція "МВ"

50 мг/кг, 28 днів

піридоксину гідрохлорид

5 мг/кг, 28 днів

Ізоніазид, 50 мг/кг, внутрішньошлунково + рифампіцин, 86 мг/кг, внутрішньошлунково, 28 днів.

композиція "МВ"

50 мг/кг, 28 днів

піридоксину гідрохлорид,

5 мг/кг, 28 днів

метіонін, 60 мг/кг,

28 днів

Водний 15%-вий розчин етанолу без обмежень, 4 місяці + ізоніазид, 50 мг/кг, внутрішньошлунково, раз на добу, останні 28 днів.

композиція "МВ"

50 мг/кг, 28 днів

піридоксину гідрохлорид,

5 мг/кг, 28 днів

метіонін, 60 мг/кг, 28 днів

Розраховували коефіцієнт кореляції (r). Результати піддавали статистичній обробці та представляли у вигляді середнього арифметичного (М) і стандартної похибки середнього арифметичного (m) для певної вибірки (n). Вірогідність різниці середніх значень досліджуваних показників оцінювали за t- критерієм Ст'юдента. Зміни вважали статистично вірогідними при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

В результаті проведених досліджень показано, що внаслідок внутрішньоочеревинного введення щурам ізоніазиду у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів активність маркерного ферменту ізоформи CYP 2E1, п-нітрофенолгідроксилази, у постмітохондріальній фракції печінки зростала відносно контролю у три рази (рис. 1).

Ошибка: источник перекрестной ссылки не найден

Рис. 1 Вплив ізоніазиду, введеного щурам внутрішньоочеревинно у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів на активність n-нітрофенолгідроксилази та швидкість аскорбат-індукованого утворення ТБК-реактантів в постмітохондріальній фракції печінки щурів

*- р<0,05 порівняно з контролем.

Це супроводжувалось збільшенням майже у 1,5 рази швидкості аскорбат-індукованого утворення ТБК-реактантів (рис. 1) та зменшенням вмісту SH-груп білків у гомогенаті печінки на 13,7 % у порівнянні з контрольною групою, що, на нашу думку, може вказувати на їх окисну модифікацію та/або взаємодію з токсичними інтермедіатами ізоніазиду.

Отримані нами дані цілком узгоджуються з літературними, де показано, що збільшення активності ізоформи CYP 2E1 є одним із потужних промоторів розвитку оксидативного стресу, здатного спричиняти загибель клітин печінки [B.E. Jones, H. Liu et al., 2002].

Ошибка: источник перекрестной ссылки не найденЗначне збільшення рівня індукції CYP 2E1 та посилення прооксидантних процесів в печінці спостерігалось також за умов внутрішньошлункового уведення щурам ізоніазиду у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів на тлі індукторів цитохрому Р-450 2Е1 - рифампіцину або етанолу. Так, активність маркера CYP 2E1, n-нітрофенолгідроксилази, та швидкість НАДФН-індукованого утворення ТБК-реактантів в мікросомах печінки зростали, відповідно, в середньому у 2,6 і 1,6 рази в залежності від експериментальної моделі (табл. 1).

Таблиця 1

n-Нітрофенолгідроксилазна активність та швидкість НАДФН-індукованого утворення ТБК-реактантів фракції мікросом печінки щурів за умов внутрішньошлункового введення ізоніазиду у дозі 50 мг/кг сумісно з рифампіцином у дозі 86 мг/кг протягом 28 днів або на тлі етанолу (4 місяці), нмоль/хв  мг білка (M + m; n  6)

Досліджувані показники

Контроль

Ізоніазид

+ рифампіцин

Контроль

Ізоніазид

+ етанол

n-Нітрофенолгідроксилазна активність

1,22 + 0,12

2,86 + 0,34*

1,74 + 0,16

5,07 + 0,22*

Швидкість

НАДФН-індукованого утворення ТБК-реактантів

1,03 + 0,14

1,71 + 0,16*

1,77 + 0,17

2,56 + 0,11*

* - р<0,05 порівняно з контролем.

Досліджуючи загальний вміст цитохрому Р-450 в мікросомах печінки щурів, яким вводили ізоніазид у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів окремо або на тлі етанолу, ми показали, що рівень вищезазначеного показника зменшувався, відповідно, на 34 % та 20 % відносно контролю (рис. 2).

Рис. 2 Вміст цитохрому Р-450 в мікросомах печінки щурів, яким протягом 28 днів вводили ізоніазид у дозі 50 мг/кг окремо та на тлі экспериментального алкоголізму

* - р<0,05 порівняно з контролем.

Причиною цього можуть бути деструктивні зміни в мембранах ендоплазматичного ретикулуму, які виникають внаслідок посилення процесів ПОЛ та ковалентна взаємодія активних метаболітів ізоніазиду та етанолу з молекулами цитохрому з наступною їх деградацією [F.P. Guengerich, 2001].

Внутрішньоочеревинне введення щурам ізоніазиду у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів призводило до збільшення активності АлАТ сироватки крові майже у 2 рази та відносної маси печінки на 50 % порівняно з контрольними тваринами. Це свідчить про різке зростання некрозодистрофічних порушень в клітинах печінки внаслідок токсичної дії реактивних інтермедіатів ізоніазиду. Під впливом ізоніазиду, внутрішньоочеревинно уведеного щурам у дозі 100 мг/кг маси тіла, також спостерігалось збільшення у 1,5 рази рівня загального білірубіну сироватки крові відносно контролю. Морфологічні дослідження печінки щурів за аналогічних умов експерименту виявили ознаки гіаліновокраплинної та гідропічної дистрофії, а також осередки некрозу печінки.

Loading...

 
 

Цікаве