WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Розробка промислової технології культивування біологічних агентів для виробництва ротавірусних антигенів (автореферат) - Реферат

Розробка промислової технології культивування біологічних агентів для виробництва ротавірусних антигенів (автореферат) - Реферат

Для визначення впливу метаболітів застосовували солі сульфату амонію та лактату натрію, які вводили у середовище культивування до досягнення концентрацій: амонію  1; 2; 4 мМ/л та лактату  25; 50; 75 мМ/л. За отриманими результатами було встановлено, що зазначені метаболіти впливають як інгібітори на ріст клітин ПКК СНЕВ. При співставленні впливу солей амонію та лактату, більш різка дія було виявлена для лактату, що свідчило про недопустимість закислення середовища культивування. Використовуючи модель впливу продукту-інгібітору на швидкість росту БА, була встановлена допустима концентрація амонію на рівні 5 мМ/л, оскільки за неї, питома швидкість росту культури наближалася до максимальної - 0,02год-1. Так як, інгібуючий вплив лактату пояснюється підвищенням осмомоляльності у середовищі культивування, що виникає внаслідок корекції низьких значень рН введенням лугів, для регуляції рН у середовищі було рекомендовано від'ємно-доливні методи чи техніку перфузії середовища культивування через насадку. З іншого боку, зменшення рівня продукції метаболітів можна викликати шляхом зменшення рівня споживання субстратів росту. Отже, зважаючи на те, що у стандартних середовищах культивування рівні вказаних субстратів лежать у межах: глюкози 1  4 г/л, глютамін у 0,1 – 0,6 г/л, та виходячи з оцінених оптимальних значень концентрацій глюкози (2.8 г/л глюкози під час інокуляції ПКК СНЕВ та 0,53 г/л глюкози під час культивування), було рекомендовано використовувати для інокуляції ПКК СНЕВ стандартні середовища з найменшим вмістом глютаміну, а концентрацію глюкози на початку культивування доводити до 2,8 г/л. Проте, оскільки було виявлено інгібуючий вплив збільшених концентрацій глюкози на питому швидкість росту ПКК СНЕВ, під час культивування було рекомендовано підтримувати її концентрацію на рівні (0,3 – 0,75) г/л.

Проектування системи культивування ПКК тварин на поверхні поліетиленової плівки. При дослідженні методів формування насадок, було зроблено висновок, що найбільш зручним та ефективним методом є формування насадки з ущільнених стрічок, які попередньо нарізаються з ПЕП. Розроблена стадія виготовлення носіїв для культивування ПКК, дозволяє створювати насадки, які складаються із стрічок поліетиленової плівки, частини якої не спікаються та не змінюють своєї площі під час стерилізації (табл. 3.).

Таблиця 3.

Стадія виготовлення та підготовки носія

Найменування операції

Опис операції

1

2

3

1

Виготовлення носіїв

Нарізання плівки поліетилену на стрічки шириною до 2 мм завширшки і до 100 мм завдовжки.

2

Знежирювання носіїв

Короткочасне промивання (до 5 хв.) виготовлених носіїв у хромовій суміші

3

Промивання носіїв

20-разове промивання знежирених носіїв у проточній та дистильованій воді

4

Випрямлення носіїв

Короткочасна (до 2 хв.) термічна обробка (t=100oC) носіїв у дистильованій воді

5

Формування насадки

Намотування м'яких термічно оброблених за п. 4. носіїв на стержень, що обертається

6

Монтаж насадки

Закріплення підготовленої насадки у посудині для культивування шляхом притискання перфорованим полімерним диском чи затисканням у перфорованому полімерному барабані

продовж. табл. 3

1

2

3

7

Підготовка до стерилізації

Дворазове промивання закріпленої у посудині для культивування, насадки нестерильним фізіологічним розчином з наступним заповненням 2/3 посудини нестерильним фізіологічним розчином

8

Стерилізація насадки

Парова стерилізація насадки, що занурена у фізіологічний розчин, при + 115оС впродовж 30 хвилин

9

Промивання насадки

Видалення фізіологічного розчину та одноразове промивання насадки стерильним розчином Хенкса для культур клітин та культуральним середовищем.

Готова насадка не розпушується та не ущільнюється під час культивування БА, характеризується високими співвідношенням площі поверхні для прикріплення та росту клітин до об'єму культивування: 1 см2/0,6 мл (рис. 4.).

Для перемішування та аерації середовища культивування було запроектовано новий перемішуючий пристрій, в основу роботи якого покладено принцип роботи водопідйомника Архімеда. Оптимальні розміри функціональних частин удосконаленого водопідйомника Архімеда було розраховано на основі модифікованого Данквертсом рівняння Хігбі. Принципова схема системи культивування із вмонтованим всередину модифікованим водопідйомником Архімеда, зображена на рис. 5.

Запропонована система культивування характеризується наступними параметрами: габаритні розміри  0,3 м х 0,3 м ; радіус вбудованої системи аерації  0,1 м; висота вбудованої системи аерації  0,1 м; площа поверхні культивування на насадці становить  3 м2; об'єм середовища культивування  2,05 л; об'єм насадки  2 л; кутова частота обертання системи  30 об/хв; режим руху середовища по каналах насадки  ламінарний; кількість клітин забезпечених киснем  1,3106 клітин/мл.

Рис. 4. Загальний вигляд частини насадки

1  посудина для культивування;

2  сітчастий короб із зафіксованою насадкою;

3  модифікований водопідйомник Архімеда;

4  циркуляційна труба;

5  кришка апарату;

 - кут дотичної до гвинтової вісі поверхні аерації;

 - кут нахилу апарату відносно вертикальної вісі;

Рис. 5. Принципова схема роботи системи культивування із перемішуючим та аеруючим пристроєм  модифікованим водопідйомником Архімеда.

У створеній системі культивування було прокультивовано ПКК СНЕВ впровдож 96 год. Оскільки прямими методами було неможливо визначити кількість клітин, що зростали на насадці, використовували визначення проліферативної активності ПКК СНЕВ, яку проводили оптичним методом з використанням стандартного розчину окисно-відновлювального індикатора резазуріну. Для цього у систему культивування в середовище вносили розчин резазуріна та інкубували впродовж 3 годин. У якості зразка порівняння, використовували іненсивність забарвлення індикатором середовища культивування у присутності клітин, які зростали у матрах об'ємом 1,5 л.

Наведені у табл. 4 результати випробування ефективності культивування ПКК СНЕВ за класичною та насадковою технологіям культивування свідчать про те, що використання насадкової технології культивування ПКК СНЕВ є більш ефективним методом нарощування клітинної біомаси ПКК СНЕВ, ніж класична технологія.

Таблиця 4

Порівняння ефективності застосування класичної та насадкової технології культивування ПКК СНЕВ.

Показники ефективності

Технологія

Класична

Насадкова

Кількість клітин, клітин/мл

1,6 106

*

Оптична густина середовища культивування, інкубованого у присутності резазуріну та клітин, OD

0,0688

0,1313

Примітка. * - неможливо визначити прямими методами.

Для дослідження рівномірності розселення клітин по насадці, клітини були забарвлені спиртовим розчином кристалічного фіолетововго. Після забарвлення клітин, насадка була розрізана вздовж своєї вертикальної вісі. На розрізі ріст клітин було відмічено на всіх ділянках насадки: як у придонній, так і у верхній її частинах. Отже, застосування у якості пристрою для рециркуляції середовища модифікованого водопідйомника Архімеда дозволило уникнути градієнтного розселення клітин по довжині насадки, і, таким чином, підвищити вихід кількості клітин. Окрім того, в глибині насадки не було виявлено зон загибелі клітин, що свідчило про забезпечення

клітин киснем навіть у глибині насадки, чого неможливо було б забезпечити, використовуючи лише поверхневий спосіб аерації.

Розробка технологічного режиму культивування БА та принципової схеми виробництва ротавірусних антигенів. Оскільки продуктивне культивування ПКК СНЕВ неможливе без відновлення спожитих субстратів та вилучення накопичених інгібіторів росту, а концентрацію іммобілізованих на насадці клітин не можна визначити прямими методами, для керування процесом культивування було розроблено алгоритм, в основі роботи якого лежить припущення про експоненціальний ріст культури. За запропонованим алгоритмом визначалися об'єми концентрованих субстратів та кратність розведення середовища, що

дозволило вести процес культивування ПКК СНЕВ у напівбезперервному режимі із порційним внесенням субстратів. Використовуючи визначені оптимальні технологічні параметри процесу культивування БА, була розроблена насадкова технологія культивування вакцинного штаму ротавірусу у напівбезперервному режимі з порційним внесенням субстратів. Апаратурно-технологічна схема виробництва ротавірусних антигенів зображена на рис. 6.

Loading...

 
 

Цікаве