WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Розробка промислової технології культивування біологічних агентів для виробництва ротавірусних антигенів (автореферат) - Реферат

Розробка промислової технології культивування біологічних агентів для виробництва ротавірусних антигенів (автореферат) - Реферат

Таблиця 1

Біоафінність поверхонь полімерних та неорганічних матеріалів

Матеріал

Форма

Фрмування клітинного моношару

1

2

3

Поліетилен

Гранули

Клітини не прикріплювалися

Стрічка

Моношар сформовано повністю

Поліпропілен

Гранули

Клітини не прикріплювалися

Стрічка

Моношар сформовано повністю

Полістирол

Гранули

Прикріплювалися окремі клітини

Стрічка

Моношар сформовано повністю

продовж. табл. 1.

1

2

3

Нержавіюча сталь

Пластинка

Моношар сформовано повністю

Кераміка

Те саме

Те саме

Склотканина

Переплетені волокна

Клітини не прикріплювалися

Поліамід

Моноволокно

Те саме

Сітка

Прикріплювалися окремі клітини

Полівінілхлорид

Трубка

Те саме

Фторопласт

Стрічка

- // -

При дослідженні якості моношарів клітин, які виросли на поверхнях зразків матеріалів, встановлено, що клітини не змінювали своєї морфології та не утворювали вогнищ дегенерації, отже, визначені біоафінні матеріали виявились не токсичними для обраних ліній ПКК. Зважаючи на те, що найдоступнішим та поширеним на ринку України з досліджених матеріалів є поліетиленова плівка (ПЕП) низької щільності, що виготовляється за ГОСТ 10354-82 для застосування у сільському господарстві та харчовій промисловості, цей матеріал було обрано як найбільш придатний для подальшого створення насадки для культивування ПКК.

При дослідженні окиснювального методу покращення біоафінності поверхні носія (поліетиленової плівки), а саме  модифікації поверхонь полімерів шляхом їх хімічного окиснення (у хромовій суміші), було виявлено, що обробку ПЕП доцільно проводити не довше ніж 5 хвилин (300 сек), оскільки більш тривале окиснення поверхні носія негативно впливає на вихід біомаси клітин (рис. 1).

Рис. 1. Кількість клітин ПКК СНЕВ, які зростали на зразках окисненої плівки: на 24, 48 та 72 години культивування, позначено Ошибка: источник перекрестной ссылки не найден, Ошибка: источник перекрестной ссылки не найден, Ошибка: источник перекрестной ссылки не найден,Ошибка: источник перекрестной ссылки не найденОшибка: источник перекрестной ссылки не найденОшибка: источник перекрестной ссылки не найден відповідно.

Визначення оптимальних умов культивування біологічних агентів. При дослідженні можливості інокуляції ПКК СНЕВ на поверхню ПЕП у малих посівних кількостях клітин, було виявлено, що фази латентного росту культури при посівних кількостях клітин: від 25 до 200 тис. клітин/мл, сильно розтягнуті (до 48 годин), у той час, як при вищих посівних кількостях, фаза латентного росту коротша (до 24 годин). Визначення кількості живих клітин ПКК СНЕВ на 48-72 годину після інокуляції на ПЕП показало, що при посівних кількостях клітин до 100 000 клітин на один мілілітр поживного середовища (чи до 50 000 клітин на см2 ПЕП), клітини ПКК СНЕВ не здатні адаптуватися до умов культивування. У свою чергу, при інокуляції ПКК СНЕВ на ПЕП у кількості 200 000 клітин/мл хоч і спостерігається подовжена lag-фаз, проте на 96 годину культивування питома швидкість росту культури близька до питомої швидкості росту для більших кількостей клітин в інокуляті: для посівної кількості 200 000 клітин – 0,29 год-1, а для більших кількостей  від 0,17 год-1 до 0,2 год-1, на відміну від повної зупинки росту при менших посівних кількостях клітин. Отже, мінімальною посівною концентрацією ПКК СНЕВ для інокуляції на поверхню поліетиленової плівки було визначено 100 000 клітин на 1 см2 поверхні росту (200 000 клітин на мілілітр живильного середовища).

З метою виявити фактори, що впливають на тривалість lag-фази при інокуляції ПКК СНЕВ у кількості 200 000 клітин/мл, було досліджено вплив середовища кондиціювання на проліферативну активність ПКК СНЕВ. Дослідження впливу середовища кондиціювання (СК) на активність росту ПКК СНЕВ проводили шляхом внесення на початку культивування від 12,5 до 50 % СК у основне живильне середовище(рис. 2).

Рис. 2. Вплив внесення середовища кондиціювання на активність проліферації ПКК СНЕВ.

За результатами підрахунку кількості клітин на першу добу культивування у середовищі без додавання СК вона зменшувалась на 10 %, у той час як у лунках із додаванням середовища кондиціювання, навпаки збільшувалась до 35%, що свідчить про позитивний вплив на проліферативну активність ПКК СНЕВ введення середовища кондиціювання.

Розрахована питома швидкість росту ПКК СНЕВ на 72 годину для проб з додаванням 50% СК була меншою, ніж для проб з меншим вмістом СК: 0,13 проти 0,33-0,37 доби-1, відповідно. Отже, для інтенсифікації росту ПКК СНЕВ було рекомендовано при інокуляції насадки додавати 25% СК до основного середовища культивування.

Для визначення оптимальної інфікуючої дози вакцинного штаму ротавірусу було проведено дослідження впливу кількості клітин ПКК СНЕВ під час інфікування на вихідний титр ротавірусу. За результатами дослідження встановлено, що при інфікуванні клітин, що зростають на ПЕП у густині більш ніж 500 000 клітин на 1 см2 поверхні, вихідний титр ротавірусу зменшується.

Окрім того, було визначено, що інфікування клітин у ранній стаціонарній фазі та пізніше негативно впливає на вихідний титр ротавірусу мавп штаму SA-11, (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив щільності клітин ПКК СНЕВ на вихід інфекційного титру ротавірусу.

Щільність ПКК СНЕВ, тис клітин/см2

250

430

665

700

Доба культивування ПКК СНЕВ

1

2

3

4

Вихідний інфекційний титр ротавірусу, lgТЦД50/0,1мл

На 24 год

2,0

3,0

2,5

2,0

На 48 год

3,5

5,5

3,5

3,0

При визначенні мінімальної інфікуючої дози ротавірусу, найкращий результат було отримано при інфікуванні клітин 100 дозами вірусу або при інфікуванні 100 000 клітин 30 ТЦД50.

Згідно з результатами, отриманими в ході дослідження впливу глюкози в межах (1-4) г/л та глютаміну (0,1-0,6) г/л на вихід кількості клітин, встановлено, що глюкоза на початку культивування, як і середовище кондиціювання, позитивно впливає на приріст клітин (рис. 3, а.). Розрахована з використанням регресивного методу аналізу даних

оптимальна концентрація глюкози для забезпечення максимального виживання клітин ПКК СНЕВ після інокуляції на ПЕП становила 2,8 г/л.

Проте, аналізуючи розраховані значення питомих швидкостей росту (рис.3, б.), було встановлено, що підвищення концентрації глюкози впливало лише на виживання клітин на 24 годину культивування, і, навпаки, збільшення концентрації глюкози негативно впливало на питому швидкість росту культури під час культивування.

Для визначення оптимальної концентрації глюкози було проаналізовано моделі впливу субстрату на питому швидкість росту БА та визначено, що модель субстратного інгібування, запропонована Вебом, найкраще описує вплив глюкози на питому швидкість росту ПКК СНЕВ (коефіцієнт детермінації даної моделі складав 0,98):

,

де - питома швидкість росту культури, год-1; max - максимальна швидкість росту, год-1; S - концентрація субстрату, г/л; KS  константа насичення субстратом; KІконстанта інгібування;b - коефіцієнт, що описує характер впливу субстрату (визначається експериментально. При b рівному одиниці рівняння Веба приймає форму рівняння Моно; концентрація субстрату (0,98), більше за нуль - субстрат впливає як активатор; менше за нуль – субстрат впливає як інгібітор).

Рис. 3. а. Вплив глюкози та глютаміну на життєздатність клітин після інокуляції; б. Вплив глюкози та глютаміну на питому швидкість росту ПКК СНЕВ.

Визначена згідно кінетичної моделі Веба за алгоритмом пошуку екстремумів функцій, оптимальна концентрація глюкози, яку потрібно підтримувати у середовищі культивування для забезпечення максимальної питомої швидкості росту ПКК СНЕВ, складає 0,53 г/л.

Дисперсійний аналіз впливу глютаміну на швидкість росту ПКК СНЕВ показав, що глютамін суттєво не впливав на питому швидкість росту ПКК СНЕВ у концентраціях, вищих за 0,1 г/л. Глютамін впливав позитивно на приріст клітин ПКК СНЕВ у межах концентрацій від 0,01 до 0,1 г/л.

Loading...

 
 

Цікаве