WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Розробка промислової технології культивування біологічних агентів для виробництва ротавірусних антигенів (автореферат) - Реферат

Розробка промислової технології культивування біологічних агентів для виробництва ротавірусних антигенів (автореферат) - Реферат

Набуло подальшого розвитку:

- дослідження позитивного впливу зменшених концентрацій глюкози під час культивування КК на питому швидкість росту клітин. Так, визначено, що під час культивування вплив глюкози на питому швидкість росту ПКК СНЕВ можна описати кінетичною моделлю субстратного інгібування. У свою чергу, для забезпечення максимальної швидкості росту ПКК СНЕВ оптимальна концентрація глюкози під час культивування має становити 0,53 г/л.

Практична цінність отриманих результатів. Розроблено технологію промислового культивування вакцинного штаму ротавірусу мавп SA-11 та поверхневозалежної культури клітин свинячої нирки ембріональної версинізованої для виробництва ротавірусних антигенів.

Запропонована технологія промислового культивування зазначених БА передбачає:

1. Використання нової системи культивування БА, яка містить:

  • - розвинену поверхню для прикріплення та росту клітин у вигляді насадки, сформованої з хаотично переплетених та ущільнених стрічок поліетиленової плівки низької щільності;

  • - нову систему рециркуляції та аерації середовища культивування, розміщену всередині апарату, в основі роботи якої лежить принцип перекачування рідини водопідйомником Архімеда.

2. Використання розробленого алгоритму керування процесом культивування БА у напівбезперервному режимі з порційним внесенням субстратів. Згідно запропонованого алгоритму розраховуються об'єми концентрованих розчинів субстратів росту, які необхідно ввести, та кратність розведення середовища для підтримки концентрацій субстратів та метаболітів на оптимальному рівні.

3. Стадію виготовлення, підготовки та стерилізації насадки з плівки поліетилену низької щільності для культивування поверхневозалежних культур клітин.

Результати випробування нової технології культивування БА для виробництва антигенів ротавірусу мавп штаму SA-11 для культуральної інактивованої протиротавірусної вакцини ветеринарного призначення "РІП-4" у ТОВ "Інститут біотехнологій" засвідчили, що впровадження нової технології культивування БА дозволяє збільшити антигенний титр ротавірусу у 4 рази порівняно з традиційною технологією культивування зазначених БА, а також, скоротити витрати на виробництво одиниці продукції у 2 рази.

Особистий внесок здобувача.Здобувачем самостійно проведено інформаційний пошук та аналіз літератури за темою дисертації. Власноруч проведені експериментальні дослідження, оброблені їх результати та виконано статистичну обробку даних. Автор також брала участь у проведенні та впровадженні розробок у дослідно-промислове виробництво інактивованої протиротавірусної вакцини ветеринарного призначення на кафедрі вірусології КМАПО.

Апробація роботи. Результати досліджень доповідались здобувачем, обговорювались та отримали позитивну оцінку на VII-ій міжнародній науково-технічній конференції "Пріоритетні напрями впровадження в харчову промисловість сучасних технологій, обладнання і нових видів продуктів оздоровчого та спеціального призначення" (Київ, 2001 р.); 68-мій науковій конференції молодих учених, аспірантів і студентів (Київ, 2002 р.); міжнародній науково-практичній конференції "Новые технологии получения и применения биологически-активных веществ" (Алушта, 2002 р.); Першій всеукраїнській науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих учених" (Київ, 2003 р.); конференції-конкурсі робіт молодих учених "Актуальні проблеми біохімії та біотехнології" (Київ, 2003 р.); ІІІ-ій міжнародній науково-практичній конференції "Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія" (Харків, 2003); 70-тій науковій конференції молодих учених, аспірантів і студентів (Київ, 2004); IV-ій міжнародній конференції "Біоресурси та віруси" (Київ, 2004); ІІ-ій міжнародній конференції "Біотехнологія. Освіта. Наука" (Львів, 2004).

Публікації. Результати дисертаційної роботи повністю відображені у 13 наукових працях, в тому числі у 5 статтях у наукових фахових виданнях, що входять до переліку ВАК України по спеціальності "Біотехнологія" та одному деклараційному патенті на винахід "Спосіб культивування поверхнево-залежних культур клітин тварин та людини" (№_20031211040), а також, у 7 тезах вітчизняних та міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, трьох розділів, висновків, списку використаних літературних джерел із 150 найменувань (50 вітчизняних і країн СНД та 100 іноземних) та 7 додатків. Робота викладена на 160 сторінках (основний текст на 100 сторінках), ілюстрована 13 таблицями, 16 рисунками, 4 фотографіями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність проблеми, визначені мета, задачі, об'єкт і предмет дослідження, сформульовано наукову новизну роботи, розкрите її теоретичне та практичне значення, визначено особистий внесок здобувача, наведені дані про апробацію отриманих результатів.

В огляді літератури подано інформацію про сучасний стан виробництва продуктів біотехнології культивування культур клітин тварин та вірусів. Наведено статистику та масштабність захворюваності людей та сільськогосподарських тварин на ротавірусну інфекцію та обґрунтовано необхідність розробки сучасної продуктивної технології культивування ротавірусу. Описані світові тенденції у створенні високоефективних систем культивування ПКК та напрямки пошуку оптимальних умов культивування культур клітин тварин.

Матеріали та методи дослідження. Під час виконання роботи використано поверхневозалежні лінії клітин тварин і людини: КК свинячої нирки ембріональної версенізованої, КК тестикулів поросят (ПТП), КК фібробластів миші (L-929) та КК аденокарциноми гортані людини (HEP-2). КК отримані з Інституту вірусних інфекцій РАМН (Єкатеринбург) та із Музею клітинних культур Інституту цитології РАН (С.-Петербург).

Для одержання ротавірусних антигенів використовували мавпячий ротавірус, штам SA-11, наданий лабораторією етіології, епідеміології і профілактики ентеровірусних інфекцій Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів ім. М. П. Чумакова РАМН. Ротавірус зберігали і пасажували на кафедрі вірусології КМАПО у клітинній лінії СНЕВ.

Під час досліджень використовували живильні середовища: модифіковане Дульбекко, мінімальне середовище Ігла (Dulbecco's modified Eagle's Medium, ДМЕМ, D 5468, Sigma), середовище 199 (М 5017, Sigma) та збагачене мінімальне середовище Ігла (МЕМ, М3024, Sigma). Для рутинного субкультивування матричної культури ПКК СНЕВ використовували суміш середовищ ДМЕМ та 199 у співвідношенні 1:1 з додаванням 5 % сироватки ембріонів корів („Сангва", Львів). Розчини глюкози та глютаміну готували із сухих порошкових реагентів високої чистоти, придатних для культивування КК (глюкоза  G7021; глютамін  G8540, Sigma), згідно з рекомендаціями виробника.

У якості носіїв органічного та неорганічного походження для дослідження можливості використання їх поверхонь для культивування ПКК, використовували: поліетиленову плівку (ГОСТ 10354-82), поліпропіленову плівку (ГОСТ 26996-86), полістиролову плівку (ГОСТ 20282-86), полівінілхлоридну трубку (ТУ 64-2-286-79), поліамідне волокно, плівковий фторопласт (ГОСТ 100007-80), нержавіючу сталь (12Х18Н10Т), радіотехнічну кераміку та склотканину.

Дослідження можливості підвищення біоафінної здатності поліетиленової плівки проводили за методикою хімічного окиснення поверхонь полімерів у хромовій суміші за умови варіювання часу окиснення: від 0 до 1800 сек. Дослідження біоафінності окиснених поверхонь поліетиленової плівки проводили, культивувуючи ПКК на стандартних поверхнях із наступним підрахунок кількості клітин, які зросли за стандартною методикою.

Визначення кількості іммобілізованих на поверхні насадки клітин проводили із використанням колориметричного методу для визначення проліферативної активності клітин шляхом їх інкубації з розчином редокс індикатора резазурина.

Дослідження впливу концентрації субстратів росту на вихід кількості клітин проводили за методом початкових швидкостей росту. Оцінку отриманих результатів проводили за допомогою регресивного та дисперсійного методів аналізу даних.

Для визначення антигенної активності ротавірусу у культуральній вірусовмісній рідині використовували специфічний еритроцитарний ротавірусний антитільний діагностикум "Ротатест" виробництва Ростовського науково-дослідного інституту мікробіології та паразитології.

Інфекційну активність ротавірусів у культуральній вірусовмісній рідині визначали мікрометодом за цитопатичною дією на ПКК СНЕВ за стандартною методикою.

Статистичну обробку отриманих в ході досліджень даних проводили загальноприйнятими методами із використанням програми "Excel", пакету "Аналіз даних", достовірність різниць оцінювали за критерієм Ст'юдента.

Аналіз і узагальнення результатів досліджень

В роботі представлені дослідження, проведені по чотирьох напрямах: вибір матеріалу для культивування на його поверхні поверхневозалежних культур клітин (ПКК) та оптимізація способу підготовки поверхні носія; оптимізація умов культивування біологічних агентів; проектування насадкової системи культивування, а також, розробка режиму культивування та принципової схеми виробництва ротавірусних антигенів.

Розробка способу культивування поверхневозалежних культур клітин на поверхнях штучних матеріалів. Досліджуючи широкодоступні на ринку України матеріали щодо придатності їх поверхонь для культивування поверхневозалежних культур клітин, було встановлено, що прикріплення та проліферація клітин можлива лише на поверхнях плівок чи пластинок полімерів. Водночас, культивування було неможливе на поверхнях гранул чи волокон тих же полімерів, а також на поверхнях поліакриламіду, полівінілхлориду та фторопласту. З іншого боку, високі ступені біоафінності по відношенню до перещеплюваних культур клітин були виявлені у харчової нержавіючої сталі та радіотехнічної кераміки (табл. 1).

Loading...

 
 

Цікаве