WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Вплив пероксиду водню на концентрацію кальцію в тимоцитах щура (автореферат) - Реферат

Вплив пероксиду водню на концентрацію кальцію в тимоцитах щура (автореферат) - Реферат

Зниження інтенсивності флуоресценції род-2 і, відповідно, концентрації іонів Са2+ в мітохондріях після додавання СССР за умови присутності дігітоніну, узгоджується з даними літератури, що пов'язують роботу мітохондріального уніпортеру за наявності потенціалу на внутрішній мембрані мітохондрії. Важче пояснити підвищення концентрації іонів кальцію в мітохондріях після додавання СССР у відсутності дігітоніну. Можливо, що при обробці клітин СССР у присутності тапсигаргину, відбувається активне вивільнення іонів Са2+ із ендоплазматичного (саркоплазматичного) ретикулуму. Це може спричиняти незначне накопичення іонів Са2+ в мітохондріях, які просторово розміщені близько від ендоплазматичного ретикулума.

Таким чином на основі вище викладених міркувань зроблено припущення, що основну роль у внутрішньоклітинному вивільненні іонів Са2+ при дії Н2О2 відіграють мітохондрії.

Мітохондріальний кальцієвий транспорт при дії пероксиду водню. Пероксид водню здатний запускати запрограмовану смерть (апоптоз) клітин. При цьому відбувається нуклеосомна фрагментація ДНК, якій передує підвищення концентрації іонів Ca2+ в цитозолі клітини. Ми дослідили, як впливає пероксид водню на зміну [Ca2+]м в мітохондріях тимоцитів. Для цього мітохондрії тимоцитів навантажували індикатором род-2. Протягом 30 хв тимоцити витримували в буферних розчинах з різними концентраціями Н2О2 (10, 50, 100 мкмоль/л) і протягом цього періоду проводили неперервну реєстрацію зміни інтенсивності флуоресценції Іф род-2 (рис. 5). Як видно з рисунку, уже невелика концентрація Н2О2 (10 мкмоль/л) спричиняла помітне зростання (≈9%) Іф род-2, що свідчить про накопичення іонів Са2+ в мітохондріях тимоцитів. Збільшення концентрації Н2О2 викликало зростання Іф род-2: Н2О2 – 50 мкмоль/л зростання Іф на 11% Н2О2 – 100 мкмоль/л зростання Іф на 14%. Такий результат узгоджується з уявленням про апоптичну дію Н2О2 на клітини, оскільки зростання концентрації іонів Са2+ в мітохондріях обумовлює відкривання мітохондріальних пор з великою провідністю (~1200 пСм), що в кінцевому результаті призводить до активації каспаз, які приймають безпосередню участь в апоптозі, і загибелі клітин.

Цитоплазматичний кальцієвий транспорт при дії пероксиду водню. Пероксид водню вільно дифундує через цитоплазматичну мембрану, що дозволяє додавати необхідну концентрацію Н2О2 до суспензії тимоцитів і через зміну флуоресценції індо-1 оцінювати зміну внутрішньоклітинної концентрації кальцію [Ca2+]i. З кінетичних кривих зміни двохвильового параметра R видно, що додавання Н2О2 до суспензії тимоцитів спричиняє зростання параметра R (рис.6): у випадку низьких концентрацій Н2О2 (10 і 25 мкмоль/л) параметр R повільно і незначно зростає в часі, в той час як за умови більш високих концентрація (50 і 100 мкмоль/л) він значно зростає і його зміна нагадує сигмоїдну криву з плато, коли після 25 хв параметр досягає максимального значення Rmax.

За отриманним значенням R ми розрахували [Ca2+]i в контрольному розчині тимоцитів (базальний рівень [Ca2+]i basal) і в тимоцитах при дії різних концентрацій Н2О2, коли параметр досягав максимального значення Rmax ([Ca2+]i max) [Grynkiewicz, 1985]. З цих даних знаходили збільшення концентрації кальцію [Ca2+]i за умови дії різних концентрацій Н2О2 (табл. 1).

Таблиця 1

Величина [Ca2+]i при дії різних концентрацій Н2О2

Концентрація Н2О2 (мкмоль/л)

[Ca2+]i (нмоль/л)

10

779

25

913

50

41018

100

81256

На рис. 7 наведена концентраційна залежність дії Н2О2 на зміну [Ca2+]i в тимоцитах. Як видно з рис. 7, невеликі концентрації Н2О2 (10-25 мкмоль/л) спричиняють незначне зростання рівня [Ca2+]i в тимоцитах. Можливо, за таких концентрацій в клітині молекули Н2О2 відіграють важливу роль як регуляторні медіатори в сигнальних процесах.

Показано, що за фізіологічно значимої концентрації Н2О2 (десятки мкмоль/л) збільшується продукція інтерлейкіна-2 в тимоцитах стимульованих антигеном, завдяки чому активується імунна відповідь цих клітин. Не виключено, що таке незначне зростання [Ca2+]i обумовлене звільненням іонів Са2+ з внутрішньоклітинних депо, зокрема, з ендоплазматичного ретикулуму тимоцитів.

Значне зростання [Ca2+]i (в 5 – 8 разів) (рис. 6) при додаванні до суспензії тимоцитів Н2О2 в концентраціях більше 50 мкмоль/л може бути сигналом для індукції апоптозу. Потужний Са2+ сигнал для індукції апоптозу вимагає, переважно, входу в клітину іонів Са2+ через Са2+-канали плазматичної мембрани. Незначний внесок в цей сигнал дає звільнення іонів Са2+ з ЕР.

На рис.8 наведена зміна за часом параметра R в тимоцитах при різних температурах. При низькій температурі, 12°С, (рис. 8, крива 1) зі значною затримкою в часі(лаг-період t ≈ 9 хв) спостерігалося ледь помітне зростання параметру R. Після 9 хв дії Н2О2 відбувалося незначне збільшення параметру ∆R на 0,03 за 10 хв.

За цими даними оцінено швидкість зростання двохвильового параметра (R/t), яка певним чином відображає швидкість зростання концентрації цитозольного кальцію. При 12є С ця швидкість є достатньо мала і становить R/t = 0,003 хв-1. Збільшення температури до 22є С спричиняло зменшення лаг-періоду (t = 1,5 хв) дії Н2О2 і значне зростання параметра, на R = 0,37, за 16 хв (рис. 7, крива 2).

При цій температурі значно збільшувалась швидкість зростання цитозольного кальцію (R/t = 0,023 хв-1). При 32є С лаг-період був <5 с і крива зміни R досить швидко (R/t = 0,036 хв-1) виходила на плато (рис. 8, крива 3). Виявлені нами значні зміни лаг-періоду при дії Н2О2 і швидкості зростання двохвильового параметра R в залежності від температури свідчать, що молекули Н2О2 завдяки окиснювальним реакціям змінюють структуру мембранних білків, які утворюють Са2+ – канали. Збільшення температури спричиняє зростання швидкості окиснювальних реакцій і кількості модифікованих білків, а відповідно і зростання швидкості транспорту іонів Са2+ через плазматичну мембрану тимоцитів. Не можна відкидати можливе зростання проникності іонів Са2+ через пошкодження мембран тимоцитів. Наші попередні дослідження показали, що молекули Н2О2 у використаних концентраціях не пошкоджують мембрани.

Як зазначалося вище, для дослідження накопичення іонів Са2+ в мітохондріях використали Са2+ –чутливий зонд род-2. При 22є С у відсутності Н2О2 в буферному розчині тимоцитів (контрольна суспензія тимоцитів) протягом тривалого часу (біля 30 хв) не спостерігалася помітна зміна інтенсивності флуоресценції Іф род-2 (рис. 5). При додаванні до суспензії тимоцитів Н2О2 (100 мкмоль/л) реєструвалося значне зростання Іф род-2, що свідчило про транспорт іонів Са2+ в мітохондрії і збільшення концентрації мітохондріального кальцію. Швидкість зростання концентрації кальцію в мітохондріях, при додаванні вказаної вище концентрації Н2О2, становила Іф/t = 0,06 хв-1. Ця швидкість зростання [Са2+]m при 22є С в 2,6 рази більше, ніж швидкість зростання цитозольного кальцію [Са2+]і при дії відповідно такої ж концентрації Н2О2. Можливо, що таке збільшення пов'язане з тим, що певна кількість іонів Са2+ може вивільнятися з ЕР через Са2+ - звільнюючі канали (IP3R) і спричиняти більш активну роботу уніпортерів мітохондрій.

Зміна цитоплазматичного рН при дії різних концентрацій пероксиду водню. Додавання пероксиду водню до клітинної суспензії тимоцитів призводить, до утворення протонів в цитоплазмі і, відповідно, до зміни внутрішньоклітинного рН, а це, в свою чергу, може впливати на [Ca2+]i. Тому нашою метою було, дослідити вплив різних концентрацій пероксиду водню на внутрішньоклітинне рН. Для визначення кількісних значень рН цитоплазми тимоцитів ми здійснили калібрування

BCECF (500 нМ) в розчині 100 мМ KCl (=0.1) з різним рН. Калібрування здійснювалось в діапазоні величин рН від 5.4 до 9.4. Зі спектрів збудження флуоресценції BCECF (рис. 9) знаходився двохвильовий параметр R=I490/I440 [Grynkiewicz, 1985].

Результати досліджень впливу Н2О2 на зміну концентрації мітохондріального вільного кальцію представлені на рис. 10. Кінетичні характеристики зміни концентрації вільного кальцію в мітохондріях подібні до змін концентрацій цитоплазматичного вільного кальцію. Відомо, що при апоптозі відбувається пригнічення Na+/H+ - обмінника. Тому при дії пероксиду водню ми спостерігаємо закиснення цитоплазми, не пов'язане з перекисним окисненням. Збільшення концентрації вільного кальцію в мітохондріях одночасно із збільшенням концентрації вільного кальцію в цитоплазмі при дії Н2О2 є ще одним свідченням апоптичних процесів в клітині.

Підвищення концентрації вільного кальцію в мітохондріях вказує на початок апоптичних процесів в клітині, що узгоджується з даними літератури. На основі отриманих даних можна зробити припущення про початок апоптичних процесів в тимоцитах при високих концентраціях Н2О2 (50 та 100 мкМ) та дію пероксиду водню як специфічного посередника при малих концентраціях Н2О2 (10 мкМ).

ВИСНОВКИ

Досліджено флуоресцентним методом зміну концентрації іонів Са2+ в цитозолі і мітохондріях тимоцитів при дії різних концентрацій Н2О2. Показано, що при зростанні температури від 120 до 320С ефективність дії Н2О2 і швидкість накопичення іонів Са2+ в цитозолі та мітохондріях тимоцитів збільшується.

Loading...

 
 

Цікаве