WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Вплив пероксиду водню на концентрацію кальцію в тимоцитах щура (автореферат) - Реферат

Вплив пероксиду водню на концентрацію кальцію в тимоцитах щура (автореферат) - Реферат

В дослідженнях на інтактних клітинах важливе значення мала гомогенність суспензії клітин. Тому вибирався тимус щура, де величина вмісту кортикальних тимоцитів становить біля 85% на відміну від селезінки, де вона складає тільки 30% загальної популяції клітин. Для одержання тимоцитів використовувались самці щурів віком біля 3 місяців, оскільки цей вік відповідає періоду зрілого тимусу, що характеризується найбільшою чисельністю клітин в тілі органу (1 – 3108 кл). Видалений тимус поміщали в бюкс з холодним розчином Кребса (+4 - +7 °С) з концентрацією СаCl2 1.2 мМ. Тимус перетирали через ситечко із синтетичного волокна, поливаючи холодним розчином Кребса. Суспензію центрифугували 10 хв. при 1500 об/хв, надосадову рідину зливали і ресуспендували осад. Кількість клітин підраховували в камері Горяєва.

Отриману суспензію тимоцитів (50106 кл/мл) навантажували індо-1/АМ (вихідний розчин індо-1 1мМ в ДМСО). Кінцева концентрація індо-1/АМ в середовищі навантаження становила 5 мкМ. Для покращення розчинення індо-1/АМ додавали Pluronic F-127 (0.05% в середовищі навантаження). Клітини навантажували індо-1 30 хв. при температурі 37 С. Після навантаження клітини відмивали від зовнішнього індо-1 центрифугуванням (3 рази).

Для контролю за внутрішньоклітинним рН тимоцити навантажувались BCECF/AM. Кінцева концентрація BCECF/AM в середовищі навантаження становила 0.5 мкМ (Pluronic F-127 0.05%). Навантаження тривало 0.5 год. при 37 С. Від зовнішнього BCECF/AM клітини відмивали центрифугуванням (3 рази, 1500 об/хв) Контроль кількості загиблих клітин проводили підраховуванням зафарбованих трипановим блакитним клітин в камері Горяєва (20 мкл суспензії клітин, 20 мкл трипанового блакитного) до навантаження індо-1 і після навантаження та відмивання.

В усіх експериментах кількість загиблих клітин не перевищувала 10%. Навантаження зондом не збільшувало кількості загиблих клітин.

В роботі використані індо-1/АМ BCECF/AM, EGTA, дігітонін, усі виробництва ("Sigma", США), HEPES ("Fluka Chemical", Швейцарія).

Для калібрування in vitro використовувались розчини "EGTA" та "Са2+ — EGTA" такого складу: "EGTA" — KCl 65 мМ, KOH 35 мМ, EGTA 10 мМ, HEPES 20 мМ, іонна сила =0.1, рН 7.2 при 22 С; "Са2+-EGTA" — KCl 65 мМ, KOH 35 мМ, EGTA 10 мМ, HEPES 20 мМ, СаСl2 10 мМ, =0.1, рН 7.2 при 22 С. При реєстрації спектрів в присутності САБ, в розчини додавався САБ — 710-6 М. Для приготування суспензії тимоцитів використовувались розчини з концентраціями кальцію 0, 2.5 мМ такого складу: 5.9 мМ KCl, 135 мМ NaCl, 1.2 мМ MgCl2, 11.5 мМ глюкози і 11.6 мМ HEPES, 1 мМ EGTA, =0.1, рН 7.2 при 22 С. В експериментах використовували деіонізовану воду 10 МОм/см. Величину рН розчинів контролювали на рН-метрі рН-150 з точністю до 0.01 одиниці рН.

Розрахунки концентрацій вільного кальцію проводили на ЕОМ за допомогою програми WinMAXC v. 1.70 люб'язно наданої К. Паттоном (Стенфордський університет). Дана програма дозволяє розрахувати концентрацію вільного кальцію за заданими загальними концентраціями СаСl2 та EGTA. Програма враховує зміни констант зв'язування EGTA при зміні температури, рН та іонної сили експериментального розчину.

Статистичну обробку результатів здійснювали за допомогою програми Origin 7.0 на ЕОМ. Числові експериментальні дані наведені як середнє арифметичне  середнє квадратичне відхилення. Для всіх дослідів число вимірювань n5. Величини коефіцієнту кореляції r коливались в межах 0.99-0.98. Лінійні залежності на графіках отримані за допомогою лінійного регресивного аналізу.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Перевірка стану плазматичної мембрани при дії пероксиду водню в тимоцитах. Пероксид водню, як один з представників АФК, має здатність окиснювати ліпіди. Окиснення ліпідів може викликати пошкодження клітинної мембрани. Отже, нашим завданням було перевірити, чи змінює пероксид водню проникність цитоплазматичної мембрани до кальцію, що може призвести до зростання проникності для позаклітинних іонів Са2+, і, як наслідок, збільшення його внутрішньоклітинної концентрації іонів [Са2+]і. Для перевірки цього ми до суспензії тимоцитів в безкальцієвому розчині Кребса додавали 100 мкмоль/л Н2О2, і, після досягнення максимального значення [Са2+]і, додавали 5 ммоль/л ЕГТА (Рис 1). ЕГТА – речовина, яка є хелатором іонів кальцію, тобто зв'язує вільні іони кальцію, зменшуючи їх концентрацію в позаклітинному розчині. За таких умов клітини повинні були б дуже швидко втратити внутрішньоклітинний кальцій, врезультаті дифузії назовні. Однак, додавання ЕГТА в розчин із суспензією тимоцитів не вплинуло на рівень [Са2+]і в цитоплазмі клітин, що вказує на відсутність змін в проникності цитоплазматичної мембрани до іонів кальцію при дії використаного в експериментах пероксиду водню.

Таким чином, можна зробити висновок, що хоча, можливо, і відбувається окиснення ліпідів цитоплазматичної мембрани клітини, але ці зміни не призводять до утворення в мембрані розривів, через які можуть проникати іони кальцію. Це твердження є справедливим для перших 30 хвилин дії пероксиду водню. За цей час повністю відбувалися зміни внутрішньоклітинної концентрації вільного кальцію. Тому ми не вважали за потрібне проводити дослідження більш тривалий термін. Не виключено, що впродовж більш тривалого терміну проникність мембрани до іонів кальцію може змінитися за рахунок окиснення мембранних ліпідів і утворення розривів, через які вище згадані іони будуть за градієнтом концентрації потрапляти в середину клітини.

Участь ендоплазматичного ретикулуму у внутрішньоклітинному звільненні іонів кальцію в тимоцитах. Наступним нашим завданням було перевірити які кальцієві депо приймають основну участь у вивільненні та поглинанні іонів кальцію в тимоцитах при дії пероксиду водню. Першим було досліджено участь ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) у внутрішньоклітинному звільненні іонів Са2+ при дії Н2О2.

Для з'ясування участі ендоплазматичного ретикулуму у внутрішньоклітинному звільненні іонів Са2+ при дії Н2О2 використовували тапсигаргін, який інгібує роботу Са2+-помпи ЕР і не впливає на Са2+-помпу плазматичної мембрани. Інкубацію тимоцитів проводили в безкальцієвому розчині Кребсу (Са2+1 мкмоль/л) тому, що в нормальному розчині Кребсу додавання тапсигаргіну спричиняло значне підвищення [Ca2+]і, яке перевищувало амплітуду Са2+-сигналу під дією пероксиду і маскувало його дію. В безкальцієвому розчині Кребсу додавання тапсигаргіну (240 нмоль/л) викликає швидке звільнення іонів Са2+ в цитоплазму, після чого [Ca2+]і протягом 15 хв повертається до початкового рівня (близько 7010 нмоль/л) (рис 2). Додавання Н2О2 (100 мкмоль/л) до суспензії тимоцитів в безкальцієвому розчині Кребсу, спричиняло зростання [Ca2+]і на 55.32 нмоль/л а зміна в часі параметра R була близька до такої

в нормальному розчині Кребсу при додаванні незначної концентрації Н2О2 (10 мкмоль/л) (рис. 2). Аплікація тапсигаргіну не впливала на підвищення [Ca2+]і, спричинене дією Н2О2. Але, в безкальцієвому розчині пул кальцію ЕР практично повністю виснажений (рис. 2) і не може дати помітного внеску в зміну концентрації вільного кальцію Са2+ ([Са2+]i). Таке невелике зростання [Ca2+]і за умов інкубації тимоцитів у безкальцієвому розчині свідчить про незначну участь ЕР у звільненні іонів Са2+ при дії Н2О2 (100 мкмоль/л).

Участь мітохондрій у внутрішньоклітинному звільненні іонів кальцію в тимоцитах. Великим за ємністю кальцієвим депо є мітохондрії. Тому ми спробували з'ясувати яку участь виконують у вивільненні та поглинанні іонів кальцію мітохондрії в тимоцитах при дії пероксиду водню.

Проведені нами модельні дослідження на тимоцитах, в яких штучно підвищували цитозольну концентрацію кальцію [Ca2+]с, провівши пермеабілізацію мембран тимоцитів дігітоніном (5 мкМ/л, протягом 2 хв). Зміну внутрішньомітохондріальної концентрації [Ca2+]м реєстрували через зміну інтенсивності флуоресценції Іф род-2. На рис. 3 наведені спектри флуоресценції род-2 в мітохондріях тимоцитів до дії дігітоніну (спектр 1) і після дії дігітоніну (спектр 2). Концентрація іонів Са2+ в розчині була фіксованою і задавалася Са2+–ЕГТА – буфером.В цьому експерименті зовнішньоклітинна концентрація кальцію становила [Ca2+]е = 1.2 ммоль/л. Як видно з рис. 3, після обробки тимоцитів дігітоніном інтенсивність флуоресценції Іф значно зростає (спектр 2), що свідчило про активування уніпортера і запасання іонів Са2+ мітохондріями.

Для перевірки того, що род-2 навантажується в мітохондріях клітин і що він реагує на накопичення Са2+ в мітохондріях ми використали протонофор СССР (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone), який є роз'єднувачем протонного градієнту на внутрішній мембрані мітохондрій

В результаті його дії зникає мембранний потенціал і, відповідно, зникає рухома сила для транспорту іонів Са2+ за участю уніпортера. Ми порівнювали кінетичні криві зміни концентрації [Ca2+]м в мітохондріях (через зміну інтенсивності флуоресценції Іф род-2) збудливих гладеньком'язових клітин матки щура (люб'язно надані Л.А. Борисовою, відділ біохімії м'язів Інституту біохімії НАН України) і в мітохондріях незбудливих клітин (суспензія тимоцитів) (рис.4, А і Б). Для усунення впливу роботи Са2+-помп саркоплазматичного ретикулуму до суспензії клітин додавався тапсигаргин. З рис. 4 видно, що і в мітохондріях гладеньком'язових клітин і в мітохондріях тимоцитів додавання дігітоніну (5 мкмоль/л) та СССР (2 мкмоль/л) спричиняє подібні зміни інтенсивності флуоресценції Іф род-2. При додаванні дігітоніну (рис. 4), підвищення інтенсивності флуоресценції вказує на зростання концентрації іонів Са2+ в мітохондріях, яке обумовлене зростанням концентрації Са2+ в цитозолі клітини.

Після додавання СССР спостерігалося зниження інтенсивності флуоресценції зонду і, відповідно, концентрації Са2+ в мітохондріях, але не до базального рівня. Навпаки, якщо спочатку до суспензії м'язових клітин чи тимоцитів додавали СССР, це призводило до невеликого підвищення концентрації Са2+ в мітохондріях, а подальше додавання дігітоніну, ще збільшувало концентрацію Са2+, але тільки до того рівня, до якого концентрація Са2+ знижувалась за умови додавання СССР після дігітоніну. При додаванні ЕГТА, інтенсивність флуоресценції Іф зонду значно зменшувалося, що свідчить про майже повне хелатування іонів Са2+ в буфері. У тимоцитах інтенсивність флуоресценції род-2 також знижувалась, але залишалась вищою від початкового „базального" рівня (рис. 4, Б).

Loading...

 
 

Цікаве