WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Вплив пероксиду водню на концентрацію кальцію в тимоцитах щура (автореферат) - Реферат

Вплив пероксиду водню на концентрацію кальцію в тимоцитах щура (автореферат) - Реферат

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

АРТЕМЕНКО ОЛЕКСАНДР ЮРІЙОВИЧ

УДК 577.24/352.4:57.044:54-39

Вплив пероксиду водню на концентрацію кальцію в тимоцитах щура

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в на кафедрі біофізики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор

Зима Валентин Леонідович

доктор біологічних наук, професор

Мірошниченко Микола Степанович

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри біофізики

Офіційні опоненти:

Рибальченко Володимир Корнійович, доктор біологічних наук, професор, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач відділу цитофізіології Інституту фізіології ім. акад. Петра Богача біологічного факультету

Бабіч Лідія Григорівна, кандидат біологічних наук, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН

України, провідний науковий співробітник, старший науковий співробітник відділу біохімії м'язів

Провідна установа: Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Захист відбудеться 30 січня 2007 року о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, пр. акад. Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215)

Поштова адреса: 01033, Київ – 33 , вул. Володимирська, 64, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.38

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033, Київ – 33, вул. Володимирська, 58)

Автореферат розісланий 27 грудня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Цимбалюк О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Іони кальцію виконують важливу роль внутрішньоклітинних посередників. Зміни внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію ([Ca2+]і) обумовлюють м'язове скорочення, вивільнення нейротрансмітерів, забезпечують регуляцію динаміки цитоскелету, фоторецепцію, ділення клітини, експресію генів та інші фізіологічні функції клітини. Регуляція рівня [Ca2+]i визначається як функціональною активністю плазматичної мембрани, так і внутрішньоклітинних органел – ендоплазматичного ретикулума, мітохондрій, ядра тощо [Carafoli, 2002]. Оскільки діючим фактором, регулятором і пусковим механізмом різноманітних клітинних функцій є концентрація вільного кальцію в цитоплазмі клітини, виникає важлива задача швидкого і точного визначення величини [Ca2+]i в інтактних клітинах.

Найбільш поширеним та перспективним є флуоресцентний метод з застосуванням кальційчутливих флуоресцентних зондів. Флуоресцентні зонди індо-1, род-2 [Grynkiewicz, 1985] та інші дають можливість неперервної реєстрації змін рівня [Ca2+]i у клітинах в стані спокою та під час дії різноманітних агоністів. Значна кількість робіт присвячена природі Са2+-сигналів в збудливих клітинах, але ще не достатньо досліджені зміни концентрації цитозольного кальцію в незбудливих клітинах.

Пероксид водню – це мала електронейтральна молекула, яка може вільно дифундувати всередину клітини. Порівняно з іншими відносно короткоживучими молекулами активними формами кисню (АФК), наприклад, супероксидним аніоном .О2-, – Н2О2 більш стійкий, хоча на його стабільність впливає рН та окисно-відновна рівновага всередині клітини. Ще більш важливим є те, що молекула Н2О2 електронейтральна і являється однією із небагатьох АФК, які вільно дифундують через клітинні мембрани. Залишок цистеїну являється легкою мішенню окиснювальної дії Н2О2, якщо він знаходиться в депротонованому стані. Безперечно, що тільки деякі клітинні білки мають цистеїн, який може окиснюватися за таких умов. Це є причиною того, що така маленька молекула, як Н2О2, може виступати у ролі специфічного вторинного посередника.

Крім того, пероксид водню, може виступати ініціатором запуску апоптозу. Цей процес, який відіграє особливу роль у підтриманні гомеостазу тканин імунної системи, зокрема тимусу, ефективно індукується під дією фізіологічних факторів, таких як специфічні цитокіни, стероїдні гормони, окисний стрес.

Важливу роль в ініціації та прискоренні апоптозу відіграє підвищення концентрації іонів кальцію у цитозолі. Причиною такого підвищення може бути, як посилення входу кальцію через плазматичну мембрану, так і порушення його внутрішньоклітинного гомеостазу, який підтримується такими системами депонування кальцію, як ендоплазматичний ретикулум та мітохондрії.

У зв'язку з цим, актуальним є дослідження зміни [Са2+]і в тимоцитах, ролі внутрішньоклітинних Са2+ - депо на її рівень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт кафедри біофізики, біологічного факультету, Київського Національного Університету імені Тараса Шевченка і виконана у межах теми № 01БФ036-07 "Дослідження та моделювання молекулярних та клітинних процесів в збудливих біологічних системах".

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було дослідити при різних температурах вплив різних концентрацій пероксиду водню на кальцієвий гомеостаз в тимоцитах щурів. Для досягнення цієї мети були сформульовані такі основні задачі:

Дослідити дію різних концентрацій пероксиду водню на зміни концентрації цитоплазматичного кальцію в тимоцитах.

Перевірити, чи впливають використані концентрації пероксиду водню на проникність цитоплазматичної мембрани до іонів кальцію.

Дослідити дію різних концентрацій пероксиду водню на зміну рН цитозолю тимоцитів.

Дослідити зміну концентрації цитоплазматичного кальцію в тимоцитах під дією пероксиду водню при різних температурах.

Об'єкт дослідження – тимоцити щура.

Предмет дослідження – вплив різних концентрацій пероксиду водню та температури на концентрацію вільного цитозольного та мітохондріального кальцію та цитоплазматичне рН.

Методи дослідження – світлова мікроскопія, флуоресцентний аналіз, статистичні методи обробки результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що при зростанні температури від 12С до 32С (дослідження проводились при трьох температурах – 12С, 22С, 32С) підвищується ефект дії Н2О2 і швидкість накопичення іонів Са2+ в цитозолі збільшується в 12 раз. Вперше встановлено відмінності в дії різних концентрацій пероксиду водню (10 мкмоль/л та 100 мкмоль/л) на зміну [Ca2+]i в суспензії тимоцитів щура.

Встановлено, що Н2О2 викликає накопичення іонів Са2+ в мітохондріях тимоцитів; підвищення концентрації кальцію в мітохондріях тимоцитів при дії різних концентрацій Н2О2 має дозову залежність. Показано, що ендоплазматичний ретикулум відіграє незначну роль у внутрішньоклітинному вивільненні іонів Са2+ при дії Н2О2. Показано, що при обробці клітин дігітоніном (5 мкмоль/л) спостерігається зростання інтенсивності флуоресценції род-2, що свідчить про швидке накопичення іонів Са2+ в мітохондріях. Протонофор СССР (2 мкмоль/л) спричиняє швидке зменшення концентрації іонів Са2+ в мітохондріях. Показано, що

використані в експериментах концентрації пероксиду водню не змінюють проникності цитоплазматичної мембрани до іонів кальцію.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані розширюють уявлення про дію різних концентрацій пероксиду водню на зміну [Ca2+]i та рН у клітинах. Результати роботи можуть бути використані для пошуку шляхів контролю

[Ca2+]i та рН у лімфоїдних клітинах за умов утворення ендогенного пероксиду водню, а також в курсах лекцій по біофізиці та спектральних методах дослідження.

Особистий внесок здобувача. Текст дисертації, формулювання основних положень та оформлення роботи виконано безпосередньо автором. Дисертантом особисто здійснені підбір та обробка даних літератури, статистична обробка результатів, а також оформлення рисунків і таблиць. Усі експерименти дисертаційної роботи виконані автором власноручно. В обговоренні результатів активну участь приймали співавтори друкованих робіт. Основні теоретичні та експериментальні ідеї було розроблено за участю д.б.н., проф. В. Л. Зими та д.б.н., проф. М. С. Мірошниченка.

Апробація результатів роботи. Основні положення дисертаційної роботи доповідались на Конференції молодих вченних і студентів з молекулярної біології і генетики, 23-25 Вересня 2003, Київ, на Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології, 25-28 квітня 2004 р., Львів, на I наукової конференції „Проблеми біологічної і медичної фізики", 20-22 вересня 2004 р., Харків.

Публікація матеріалів. По матеріалам дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових виданнях, які затверджені переліком ВАК України та 3 тезах доповідей у матеріалах міжнародних та всеукраїнських наукових конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 136 сторінках друкованого тексту, містить 15 рисунків, 1 таблицю. Робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, висновків, списку використаних джерел (145 посилань).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень.Спектри кальційчутливих зондів індо-1 і род-2 та рН-чутливого зонда BCECF в розчинах та в суспензії тимоцитів, записували на спектрофлуориметрі СДЛ-2. Флуоресценцію індо-1 збуджували на довжині хвилі зб=350 нм. Флуоресценцію род-2 збуджували на довжині хвилі зб=530. нм Спектри збудження BCECF реєстрували на р=535 нм. Флуоресценція індо-1, род-2 та BCECF реєструвалась під кутом 90 до променя збуджуючого світла з 1 см кювети в спектральному інтервалі від 360 до 600 нм, від 560 нм до 700 нм та від 360 до 530нм, відповідно, з смугою пропускання 0.5 нм на монохроматорі флуоресценції. Концентрації індо-1, род-2 та BCECF в розчинах були 5 мкМ, 0,5 мкМ та 0.5 мкМ, відповідно. Спектри записували та зберігали в ASCII кодах з можливістю подальшої обробки за допомогою програмного забезпечення.

Loading...

 
 

Цікаве