WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Центромерна нестабільність та поліморфізм хромосом в нормі і при патології людини (автореферат) - Реферат

Центромерна нестабільність та поліморфізм хромосом в нормі і при патології людини (автореферат) - Реферат

Рівень індукції апоптозу досліджено у 35 дорослих волонтерів (контрольна група), 13 хворих на гемобластози дитячого віку, 39 дітей з екологічно несприятливого регіону (м. Соснівка Львівської області), 10 пацієнтів з СХН, а також у 32 зразках ГЕПК людини. Імуногістохімічні дослідження експресії білків P53 та Bcl-2 проводили у 10 зразках ембріональної печінки та 11 — ворсин хоріону. Молекулярно-генетичні дослідження здійснено у 54 випадках NBS-подібного фенотипу, у 2 плодів з високим ризиком NBS, 9 випадках вірогідної атаксії-телеангіектазії, 14 батьків дітей з СХН, а також у 20 пацієнтів чоловічої і жіночої статі з порушеннями статевої диференціації.

Матеріали та методи досліджень. Дослідження проводили на клітинах крові, кісткового мозку, ГЕПК, хоріону, плаценти та амніотичної рідини людини, культивованих ex vivo або in vitro.

Культивування лімфоцитів периферичної крові та отримання препаратів метафазних хромосом проводили за стандартним методом D.A. Hungerford (1965). При виготовленні препаратів хромосом з культивованих клітин кісткового мозку та крові хворих на гемобластози враховували рекомендації B. Gibbons та B.H. Czepulkowski (1992). Препарати хромосом гемопоетичних ембріональних печінкових клітин отримували з матеріалу ембріональної печінки артифіціальних абортусів після 2-годинного культивування в присутності колхіцину (ex vivo) за методикою О.О. Созанського із співавторами (1989). Отримання препаратів метафазних хромосом з клітин плаценти та ворсин хоріону ex vivo проводили за методом G. Simoni (1983). Для культивування клітин амніотичної рідини використовували метод Д.В. Заставної (2003). Виготовлення препаратів хромосом з амніоцитів проводили за методом, розробленим Н.Л. Гулеюк і за нашої участі (2003), новизна якого засвідчена патентом на винахід.

Рівномірно забарвлені препарати хромосом з використанням 4% розчину барвника Гімза ("Merck", Німеччина) застосовували для реєстрації хромосомних аберацій, передчасного розділення центромер (ПРЦ) та для аналізу плоїдності клітин. Дослідження структурної організації хромосом проводили з використанням G-забарвлення препаратів хромосом 2% розчином барвника Гімза за методом M.A. Seabright (1971) у власній модифікації. Структурно-функціональну організацію центромерних ділянок хромосом оцінювали на C-забарвлених препаратах хромосом (A.T. Sumner, 1972).

Візуальний хромосомний аналіз проводили при збільшенні х 1000 на мікроскопах "Axioplan" (Німеччина) та "Nikon" (Японія) з фотографуванням препаратів хромосом. При аналізі 100 метафазних пластинок (м.п.) реєстрували кількісні та структурні аномалії хромосом, факти анеуплоїдії, поліплоїдії та передчасного розділення центромер сестринських хроматид (ПРЦ). Для визначення структурних перебудов застосовували Міжнародну номенклатуру ISCN—1995. При аналізі хромосомних аберацій враховували всі аберації хромосомного та хроматидного типів, за винятком пробілів. Дослідження явища ПРЦ проводили на основі алгоритму, вперше запропонованого і впровадженого у даному дослідженні. Оцінку С-поліморфних варіантів хромосом 1, 9, 16, 13—15, 21, 22 та Y проводили за 5-бальною напівкількісною системою, розробленою в Інституті медичної генетики РАМН (1981), та із застосуванням методики кількісного аналізу, розробленої при виконанні кандидатської дисертаційної роботи (Г.Р. Акопян, 1988).

Молекулярно-генетичні дослідження проводили з використанням ДНК лейкоцитів периферичної крові, виділеної методом ферментативного розщеплення та подальшої фенольної екстракції (Т. Маниатис, 1988; G.D. Efremov, 1999). Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) проводили в автоматичному режимі на термоциклерах "АМП-4" (м. Новосибірськ, РФ), "Perkin Elmer" 4800 nf 2400 ("Cetus", США), "AMPLY-4" (ф-ма "Биоком", м. Москва, РФ). Реактиви виробництва "MBI Fermentas" (Литва), олігонуклеотидні праймери синтезовані в Інституті біоорганічної хімії РАН (м. Москва, РФ). Молекулярно-генетичний аналіз мутації 657del5 гена NBS1, асоційованого з синдромом Ніймеген (NBS), проводили за методом R. Varon із співавторами (1998) на основі ПЛР з використанням олігонуклеотидних послідовностей, що фланкують сайт виникнення делеції. Фрагменти розділяли в 8% поліакриламідному гелі. Для верифікації мутації 657del5 гена NBS1 зразки було секвеновано на автоматичному секвенаторі ABI PRIZM 310 з використанням флюоресцентно мічених ddNTP3 згідно технології BigDyeTM ("Applied Biosystems"). За методом M. Telatar із співавторами (1998) проводили дослідження 7 типових мутацій гена ATM, асоційованих з атаксією-телеангіектазією (А-Т): IVS53-2AC (codon 2544del 159nt екзону 54), 6095GA (codon 2003 екзону 43), 7010 del GT (codon 2337 екзону 50), 5932GT (codon 1973del88nt екзону 42), 3214GT (codon 1026del207nt екзону 24), 3245 ATCTGAT (codon 1081 екзону 24), 7636del9nt (codon 2546 екзону 54). Ефективність ПЛР перевіряли шляхом гель електрофорезу в 3% агарозному гелі з наступною візуалізацією бромистим етидієм.

Проточноцитометричні дослідження апоптозу проводили у відділі клінічної імунології Інституту онкології АМН України та у клінічній лабораторії ЛДСКЛ з використанням приладів FACScan ("Becton Dickinson, USA), обладнаних аргоновим лазером з довжиною хвилі 488 нм та програмним забезпеченням CellQuest для комп'ютерів Мас. Клітини забарвлювали пропідієм йодидом, а для вимірювання його флюоресценції застосовували вузькосмуговий фільтр 585/42 нм. Реєстрацію клітин з апоптотичною втратою ДНК проводили шляхом кількісного аналізу гіподиплоїдної зони гістограми ("sub-G1-peak") за методом I. Nicoletti із співавторами (1991). Показники питомого вмісту клітин з різною кількістю ДНК в основних фазах мітотичного циклу (G1/0, S, G2+М) обробляли з використанням програми Mod Fit LT 2.0 (BDIS, USA).

Дослідження апоптозу шляхом люмінесцентної мікроскопії препаратів клітин, прижиттєво забарвлених акридином оранжевим, проводили у відділенні регуляторних систем клітини Інституту біології клітини НАН України за методом Н.В. Крищишина та М.Д. Луцика (1978) у власній модифікації. Препарати клітин аналізували з використанням люмінесцентного мікроскопу ЛЮМАМ-Р2 (ЛОМО, м. Санкт-Петербург, Росія) при збільшенні х 500 в області збудження 360—440 нм та емісії 480—700 нм. Аналізували по 300 клітин випадково знайдених під мікроскопом з фотографуванням препаратів на кольорову фотоплівку Fuji 100. Факт життєздатності або апоптичної загибелі клітин встановлювали в залежності від характеру люмінесценції з врахуванням рекомендацій K. Gasiorowski із співавторами (2001).

Реєстрацію цитологічних ознак апоптозу проводили за методом B.C. Trauth та J. Keesey (1995) на стандартно зафіксованих мазках крові та препаратах метафазних хромосом, забарвлених 4% барвником Гімза при збільшенні х 1000. При аналізі 150—200 клітин у кожному зразку проводили вибіркову реєстрацію клітин з виразною фрагментацією ядра та відшаруванням апоптичних тілець. Інші ознаки апоптичної морфології клітин не враховували.

Імуногістохімічні дослідження проводили в інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького з використанням моноклональних антитіл (DAKO, Данія). По завершенні імуногістохімічної реакції, зрізи тканин фарбували гематоксиліном, укладали в бальзам та досліджували у світловому мікроскопі при збільшенні х 400. При аналізі 200 клітин проводили напівкількісну реєстрацію інтенсивності сигналу із визначенням особливостей його локалізації.

Статистична обробка результатів дослідження проводилась за допомогою пакету програм "Statistica 5" та Microsoft Excel — 2000. Достовірність різниці середніх значень показників в досліді і контролі, а також значимість коефіцієнтів лінійної регресії і кореляції оцінювали при 95%-й ймовірності і вище. Застосовували критерій Пірсона ч2 у випадках доведеного нормального характеру розподілу вибірок, а також метод непараметричної статистики (U-тест Mанна-Уітні) для порівняльного аналізу рядів з незалежним розподілом вибірок при 95%-й ймовірності і вище.

Loading...

 
 

Цікаве