WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Розробка методів аналітичної діагностики отруєнь вальпроєвою кислотою (автореферат) - Реферат

Розробка методів аналітичної діагностики отруєнь вальпроєвою кислотою (автореферат) - Реферат

Для виявлення вальпроєвої кислоти був розроблений варіант реакційної тонкошарової хроматографії. Як реагент був використаний 3-(2-бромацетил)-7-метоксикумарин 1, який при взаємодії з вальпроєвою кислотою в присутності триетиламіну утворює 2-(7-метоксикумарин-3-іл)-2-оксоетиловий ефір вальпроєвої кислоти 2 (схема 1).

Для визначення оптимальних умов взаємодії суміш еквімолекулярних кількостей вальпроєвої кислоти, триетиламіну і 3-(2-бромацетил)-7-метоксикумарину витримувалась у термостаті при температурах 300С і 600С. Кожні 5 або 10 хвилин відбиралась проба реакційної суміші і хроматографувалась паралельно з 3-(2-бромацетил)-7-метоксикумарином в системі №20 (толуол-етанол-гексан (4:1:5):

Схема 1. Реакція утворення 2-(7-метоксикумарин-3-іл)-2-оксоетилового ефіру вальпроєвої кислоти 2.

Після хроматографування пластинки в УФ-світлі було виявлено по 2 добре розділені та флуоресціюючі плями: перші – жовтого кольору, відповідні до реагенту 3-(2-бромацетил)-7 метоксикумарину (1), інші – жовто-зеленого кольору відповідні продукту його взаємодії з вальпроєвою кислотою (2).

Далі, сорбенти з фрагментів пластинок, які відповідають флуоресціюючим плямам ефіру (2) екстрагувались етанолом і визначалась оптична густина одержаних розчинів при 296 нм (максимум поглинання продукту реакції). При цьому було встановлено, що реакція між вальпроєвою кислотою і 3-(2-бромацетил)-7 метоксикумарином закінчується при температурі 300С за 80 хвилин, при 600С – за 30 хвилин.

Межа виявлення вальпроєвої кислоти у біологічному матеріалі цим методом складає 1 мкг у плямі. Далі дослідженню були піддані речовини кислої природи. Хроматографування проводилось у 6 системах розчинників: №1 і 16-20 (№16 толуол-етанол (10:0,1); №17 хлороформ-ацетон (9:1); №18 толуол-етанол-гексан (6:0,5:3,5); №19 толуол-етанол (8,5:1,5); №20 толуол-етанол-гексан (4:1:5).

В усіх системах вихідний реагент і продукти реакцій добре відрізняються один від одного, а системи №16 і 17 є некорелюючими, що підвищує вірогідність ідентифікації. Розроблене виявлення вальпроєвої кислоти методом реакційної тонкошарової хроматографії може бути використане як підтверджуючий метод при відсутності в лабораторії газорідинної і високоефективної рідинної хроматографії, що істотно підвищує рівень доказовості виявлення вальпроєвої кислоти.

Виявлення і визначення вальпроєвої кислоти у біологічному матеріалі методом газорідинної хроматографії

Вальпроєва кислота – летка сполука, і можна було припустити, що при проведенні досліджень на технічні розчини, вона буде перешкоджати визначенню. Однак, проведене дослідження на трьох колонках різної полярності (сквалан, динонілфталат і ціанетоксипропан) в умовах методики виявлення технічних рідин показало, що вальпроєва кислота не має хроматографічної рухливості і тому не перешкоджає виявленню технічних рідин.

Виявлення вальпроєвої кислоти вдалося здійснити на другій колонці з 5% SE-30 на Хроматоні N-AW-HMDS. Детектор – полум'яно-іонізаційний. Паралельно з вальпроєвою кислотою вводили природний метаболіт організму людини – оцтову кислоту. Речовини вводились в розчині етанолу. Дослідження показало, що компоненти суміші повністю розділяються в умовах визначення (рис. 3).

Рис. 3. Хроматограма розчину вальпроєвої(3) і оцтової(2) кислот в етанолі(1).

Для підвищення вірогідності виявлення була використана перед-колоночна реакційна хроматографія. Для цього порівняльному хроматографічному дослідженню було піддано вальпроєву, бензойну, саліцилову кислоти та їх кумаринові ефіри, одержані в раніше описаних умовах. Як виявилося, час виходу вальпроєвої кислоти і її кумаринового ефіру значно відрізняється від інших медикаментів і їх кумаринових ефірів, що дозволяє проводити її надійну ідентифікацію у присутності інших лікарських засобів із групи карбонових кислот.

Наступним етапом дослідження стала розробка умов кількісного визначення вальпроєвої кислоти. Дослідження проводилось на газовому хроматографі Кристал-5000, який має таку конфігурацію: колонка капілярна з прищепленою фазою "НР-5" (15м х 0,53мм х 0,5мкм); програмування температури: 1100С, 200С/хв до 2000С); полум'яно-іонізаційний детектор (2200С); інжектор без розділення потоку (2100С). газ-носій – гелій, тиск 10 кПа.

Визначення проводилось методом абсолютного градуювання. У всьому досліджуваному діапазоні концентрацій залежність концентрація – площа піка лінійна, описується рівнянням:

С = 0,000132 х S,

де С – концентрація (мкг/мл);

S – площа піка.

Розроблена методика кількісного визначення вальпроєвої кислоти була випробувана на чотирьох модельних розчинах різної концентрації. При цьому було встановлено, що відносна невизначеність середнього результату при кількісному визначенні вальпроєвої кислоти не перевищує 2 %.

Розроблена методика була використана для вивчення ізолювання вальпроєвої кислоти із біоматеріалу різними методами і визначення її збереження у гнильно-зміненому біологічному матеріалі. При цьому було встановлено, що протягом 5 місяців вміст вальпроєвої кислоти у біологічному матеріалі зменшується до 40 % від вихідного.

Виявлення і визначення вальпроєвої кислоти у крові методом реакційної високоефективної рідинної хроматографії

Пряме визначення вальпроєвої кислоти методом високоефективної рідинної хроматографії з ультрафіолетовим детектуванням неможливе, тому було цікаво розробити визначення вальпроєвої кислоти в крові методом реакційної ВЕРХ, що дозволяє використання спектрофотометричного і флуориметричного детекторів, для чого необхідно було вивчити різні варіанти пробопідготовки крові, включаючи вибір умов депротеїнізації, екстракції і пошук оптимальних умов хроматографічного розділення.

Дослідження проводили на рідинному мікроколоночному хроматографі "Міліхром А-02" на колонці із збіднілою фазою Pronto SIL-120-5-C18AQ. Режим елюювання – градієнтний. УФ-детектування при довжині хвилі 300 нм.

Для оптимізації процесу депротеїнізації випробовувались різні реагенти: етанол, ацетонітрил, фосфорно-вольфрамова, трихлороцтова та хлористоводнева кислоти. Найкращі результати були одержані при використанні ацетонітрилу, що слід вважати позитивним моментом, враховуючи подальше застосування ВЕРХ як кінцевої аналітичної операції. Інші осаджувачі призводили до значних втрат вальпроєвої кислоти при депротеїнізації. Для очищення цілевих компонентів від найбільш гідрофобних сполук (ліпідів) останні екстрагувались гексаном.

Крім того, для порівняння, ізолювання вальпроєвої кислоти проводили екстракційним методом із сухої суміші крові з натрію сульфатом. Як екстрагенти вживали хлороформ, діетиловий ефір та етанол.

Найбільший вихід вальпроєвої кислоти було одержано при осадженні білків ацетонітрилом, що і було використано далі при розробці методики визначення вальпроєвої кислоти в крові.

Оскільки вальпроєва кислота не має власного поглинання в ультрафіолетовій області спектру, для розробки методики її визначення була використана предколонкова дериватизація за допомогою 3-(2-бромацетил)-7 метоксикумарину. Дериватизації піддавали сироватку крові після депротеїнізації і видалення гексаном гідрофобних сполук.

Паралельно порівняльному хроматографічному дослідженню були піддані кумаринові ефіри бензойної, саліцилової, мефенамінової кислот і диклофенаку. Як виявилось, часи виходу кумаринових ефірів вальпроєвої кислоти та інших речовин значно відрізняються один від одного, що дозволяє проводити її надійну ідентифікацію в присутності цих лікарських засобів. Найбільший час виходу у мефенамінової кислоти (рис.4).

Для визначення вальпроєвої кислоти в крові використовували метод абсолютного градуювання, для чого було побудовано градуювальний графік в інтервалах концентрацій 10-1000 мкг/мл. Після обробки одержаних даних методом лінійного регресійного аналізу була одержана лінійна залежність у всьому діапазоні концентрацій, які вивчалися, виражена рівнянням:

S = 0,1037+0,1329C,

де S – площа піка;

C – концентрація (мкг/мл).

Метрологічні характеристики методу визначались на чотирьох модельних зразках крові з відомим вмістом вальпроєвої кислоти. Результати досліджень свідчать, що невизначеність результатів виміру складає близько 8 %, що не перевищує припустимі межі прийняті для біоаналітичних методів.

Рис. 4. Хроматограма кумаринових ефірів вальпроєвої (1) та мефенамінової (2) кислот.

Алгоритм дослідження біологічного матеріалу на вальпроєвую кислоту при спеціальному завданні

На основі проведених досліджень нами був розроблений алгоритм токсикологічного дослідження для аналітичної діагностики отруєнь вальпроєвою кислотою (схема 2).

Зважаючи те, що при отруєнні вальпроєвою кислотою, концентрація останньої в органах досить велика, для її виявлення достатньо 25 г ткани органів. Ізолювання слід проводити екстрагуванням органічними розчинниками із підкисленого гомогенату біоматеріалу з безводним натрію сульфатом (екстракт 1).

Loading...

 
 

Цікаве