WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Розробка методів аналітичної діагностики отруєнь вальпроєвою кислотою (автореферат) - Реферат

Розробка методів аналітичної діагностики отруєнь вальпроєвою кислотою (автореферат) - Реферат

Публікації. Матеріали дисертаційної роботи опубліковані у 7 наукових працях, у тому числі 3 статті у наукових фахових виданнях і 4 тез доповідей.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, 6 розділів, загальних висновків, списку літературних джерел та 8 додатків. Загальний обсяг дисертації складає 134 сторінки машинописного тексту. Робота ілюстрована 11 рисунками і 24 таблицями та 4 схемами. Обсяг основного тексту дисертації складає 108 сторінок. Список використаних літературних джерел містить 152 найменування, з них 37 кирилицею та 115 латиною.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Вальпроєва кислота – ди-(н-пропіл)-оцтова кислота є препаратом першого вибору у лікуванні епілепсії, високоефективна при всіх типах епілептичних нападів, має також антидепресантну, антиманіакальну та антимігренозну активність.

Вивчення ізолювання вальпроєвої кислоти із органів і біологічних рідин трупа

Ізолювання вальпроєвої кислоти із твердих біологічних об'єктів з метою судово-токсикологічного дослідження раніше не проводилось. Тому було цікаво провести порівняльне дослідження загальновживаних у токсикології методів – Васильєвої і Стаса-Отто, а при необхідності розробити новий.

Вивчення ізолювання вальпроєвої кислоти проводилось на модельних сумішах, які одержували затравкою тканин печінки. При цьому була встановлена неефективність методів Васильєвої і Стаса-Отто для ізолювання вальпроєвої кислоти (виходи: 8,6 % і 10,8 %, відповідно).

Істотно вдалося підвищити вихід, екстрагуючи вальпроєву кислоту із підкисленого гомогенату тканин печінки з безводним натрію сульфатом органічними розчинниками (86,2 % при використанні ефіру та 72,4 % – хлороформу).

Важливим, з токсикологічної точки зору, об'єктом аналізу є сеча, оскільки сама вальпроєва кислота та її метаболіти виділяються з організму переважно з сечею. Ізолювання вальпроєвої кислоти із сечі вивчалось на модельних сумішах. Виявилося, що процеси ізолювання вальпроєвої кислоти з сечі підкоряються загальним закономірностям. Так, розраховане значення рН початку зони максимальної екстракції (рН=3) і експериментально знайдене оптимальне значення рН співпали.

Враховуючи, що значна частина вальпроєвої кислоти виводиться у вигляді свого метаболіту – глюкуроніду, було доцільно вивчити умови його гідролізу, що істотно знизило б мінімум вальпроєвої кислоти, який визначається, у біологічному матеріалі. Методи пробопідготовки містили два варіанти кислотного гідролізу за методиками, які прийняті при визначення опіатів і бензодіазепінів, а також трьох варіантів лужного гідролізу. З них один, який використовується при дослідженні на канабіноїди, два інші, рекомендовані нами – 2M розчином калію гідроксиду при нагріванні та на холоду.

Виявлення вальпроєвої кислоти у гідролізаті проводилось методом хромато-мас-спектрометрії. Час утримання вальпроєвої кислоти складав 4,48 хв (рис.1).

Рис. 1. Хроматограма сечі, яка отримана після гідролізу 2М

розчином калію гідроксиду.

Речовина з цим часом утримання показала добовий збіг виявлених іонів з бібліотечним спектром вальпроєвої кислоти (96 із 100): 73, 102, 41, 43, 55 (рис.2).

Рис. 2. Мас-спектр речовини з часом утримання о 4,48 хв.

Найбільш низькі виходи вальпроєвої кислоти були одержані при кислотному гідролізі, що, вочевидь, пояснюється її леткістю.

Оптимальним варіантом лужного гідролізу глюкуроніду вальпроєвої кислоти виявився гідроліз 2M розчином калію гідроксиду при 500С на протязі 20 хв., що забезпечило максимальний її вихід. Ці умови пробопідготовки і були покладені в основу методики визначення вальпроєвої кислоти у сечі.

Виявлення вальпроєвої кислоти у біологічному матеріалі методом тонкошарової хроматографії

При діагностиці гострих отруєнь людини на першій стадії дослідження використовують методологію скринінгу, і при вивченні нової речовини необхідно перш за все визначити його хроматографічну рухливість у стандартних скринінгових хроматографічних системах, а також перелік речовин, які зможуть перешкоджати його виявленню. Тому, для порівняльного дослідження були вибрані широко застосовувані медикаменти кислої природи (бензойна, саліцилова, ацетилсаліцилова кислота, індометацин, вольтарен, мефенамінова кислота), лікарські засоби, що вживаються разом з вальпроєвою кислотою (парацетамол, фенобарбітал, барбітал, клоназепам), а також природний метаболіт – оцтова кислота.

Вивчення хроматографічної рухливості вказаних засобів проводилось у системах, що рекомендовані Міжнародним Комітетом з систематичного токсикологічного аналізу: 1) хлороформ-ацетон (8:2); 2) етилацетат; 3) хлороформ-діоксан-ацетон-25% розчин аміаку (47,5:45:5:2,5); 4) хлороформ-н-бутанол-25% розчин аміаку (79:40:5); 5) діетиловий ефір-ацетон-25% розчин аміаку (40:20:1); 6) бензол-ізопропанол-25% розчин аміаку (85:15:1), що прийняті у вітчизняній системі скринінгу; 7) хлороформ-етанол (9:1); 8) етанол; 9) етилацетат-етанол-25% розчин аміаку (85:10:5); 10) толуол-ацетон-етанол-25% розчин аміаку (45:45:7,4:2,5); 11) етилацетат-ацетон-25% розчин аміаку (50:45:4); 12) метанол-25% розчин аміаку (100:1,5); 13) бензол-метанол-діетиламін (90:10:10), а також запропоновані нами: 14) толуол-етанол-гексан (6:1:3); 15) толуол-етанол-гексан (6:3:1).

В системах №1-6, величини Rf вальпроєвої кислоти наближаються до нуля і тому вони не можуть бути використані для її виявлення. У хроматографічних системах, які використовуються у вітчизняному скринінгу (№7-13), вальпроєва кислота має достатню рухливість, однак, вони виявилися недостатньо селективними для відокремлювання її від інших досліджуваних речовин кислої природи. Із систем, що були запропоновані нами, найбільш селективною є система №14, в якій вальпроєва кислота має значення Rf близьке тільки з бензойною кислотою. Системи №14 і №15 мають достатню селективність для відокремлювання вальпроєвої кислоти від інших речовин кислого характеру, а по відношенню до вальпроєвої і бензойної кислот є некорелюючими, що значно підвищує вірогідність ідентифікації (табл.1).

Таблиця 1

Параметри хроматографічної рухливості досліджуваних речовин у запропонованих системах

Речовина

Величини hRf в системах

14

15

1

2

3

Вальпроєва кислота

29

65

Ацетилсаліцилова кислота

18

47

Диклофенак натрію

8

35

Продовж. табл.1

1

2

3

Індометацин

0

0

    1. Бензойна кислота

35

58

Мефенамінова кислота

21

59

Саліцилова кислота

12

35

Оцтова кислота

0

0

Фенобарбітал

37

67

Клоназепам

11

45

Барбітал

35

67

Парацетамол

12

52

Можливості скринінгової системи визначаються не тільки її селективністю, але й набором реактивів – проявників. Нами для візуалізації речовин на пластинках використовувався стандартний набір реактивів, який вживається у скринінгу: пари йоду, реактиви Ван-Урка, Браттона-Маршалла, 1 % розчин калію перманганату у сірчаній кислоті, розчин заліза (ІІІ) хлориду, послідовне нанесення 2% розчину ртуті сульфату і 0,05 % розчину дифенілкарбазону у хлороформі. Вказані реагенти не проявляють вальпроєву кислоту. Таким чином, існуючі системи скринінгу токсичних речовин не дозволяють виявити вальпроєву кислоту у біологічному матеріалі. Враховуючи, що в структурі вальпроєвої кислоти є карбоксильна група, ми спробували використати як проявники розчини інших солей важких металів, а також розчини кислотно-основних індикаторів.

Із солей важких металів найбільш селективними виявили себе реактиви на основі 0,3М аміачного розчину сульфату міді і, особливо, 0,3М розчину сульфату міді з подальшою обробкою розчином о-толуїдину в ацетоні.

Враховуючи наявність у структурі всіх карбонових кислот карбоксильної групи, цікаво було випробувати для візуалізації кислотно-основні індикатори (метиловий червоний, бромкрезоловий зелений, підкислений оцтовою кислотою, бромкрезоловий пурпуровий, бромтимоловий синій, ксиленовий помаранчевий, алізариновий жовтий). Під час обприскування цими проявниками були одержані цікаві результати. Так, всі використані індикатори виявляють більш сильні ароматичні кислоти, і лише метиловий червоний, бромкрезоловий зелений і бромкрезоловий пурпуровий – аліфатичні (вальпроєву та оцтову кислоти). Ще більш слабкі кислоти (барбітурати) досліджувані реактиви не проявляють. Найбільш перспективними для виявлення як ароматичних, так і аліфатичних карбонових кислот слід вважати проявники на основі метилового червоного, який поєднує в собі високу чутливість (0,1 мкг/пляма) та контрастність. Цей реактив рекомендується для включення в систему токсикологічного скринінгу для виявлення у біологічному матеріалі речовин кислої природи. Таким чином, поєднання використання вказаних реактивів та запропонованих хроматографічних систем дає можливість виявити вальпроєву кислоту і диференціювати її від інших речовин кислого характеру.

Loading...

 
 

Цікаве