WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Апоптоз, імунофенотип та функціональна активність елементів гемопоезу у хворих на мієлодиспластичний синдром у віддалений період після опромінення (ав - Реферат

Апоптоз, імунофенотип та функціональна активність елементів гемопоезу у хворих на мієлодиспластичний синдром у віддалений період після опромінення (ав - Реферат

Обстеженим особам з встановленим діагнозом МДС проведено імунофенотипування клітин ПК та КМ методом лазерної проточної цитофлуориметрії. Субпопуляційний склад лейкоцитів та експресію поверхневих антигенів визначали у прямому імунофлуоресцентному тесті за допомогою панелі моноклональних антитіл (МКАТ) серії Leu фірми Becton Dickinson (BD) методом дво- та трьохкольорового аналізу. Антитіла, були мічені флуорусцеїнізоцианатом (FITC) та фікоеритрином (PE). За специфічністю використані МКАТ розподілялись наступним чином: CD45/CD14 – диференціювання лімфоцитів, моноцитів та гранулоцитів; CD34, CD117, CD71, CD10 – антигени клітин-попередників; CD33, CD13 – лінійні мієлоїдні антигени, які експресуються на клітинах мієлоїдного походження різного ступеня дозрівання; CD3/CD22, CD5/CD20, CD7, CD19 – визначення загальної кількості Т- та В-клітин; CD4/CD8 – оцінка імунорегуляторних субпопуляцій Т–лімфоцитів; HLA-DR/CD56 – оцінка цитотоксичних Т-лімфоцитів та природних кілерів. Контролем були мікросфери "CaliBRITE" (BD), помічені відповідно FITC чи РЕ, та МКАТ до імуноглобулінів миші IgG1 – FITC / IgG2a – PE.

Зразки готували за рекомендаціями по використанню набору Acute Leukemia Phenotyping Kit (BD, США). За стандартним протоколом аналізу даних проточної цитометрії пряме (FSC) та бокове (SSC) світлорозсіювання було використано для виділення трьохчасткового диференціювання популяцій клітин. Визначення інтенсивності флуоресценції (ІФ) у зеленому спектрі (FITC) – перший канал флуоресценції (FL1) та у червоному спектрі (PE) – другий канал флуоресценції (FL2) проводили у логарифмічному режимі. Коефіцієнти електронної компенсації спектрів флуоресценції складали 0,7% для FL1 та 18% для FL2. Аналіз проводили на лазерному проточному цитофлуориметрі FACScan (BD, США). Для збудження використовували аргоновий лазер потужністю 25мВт (довжина хвилі 488 нм). Первинний аналіз проводили з використанням програми збору та обробки даних Lysis II.

Проліферативний потенціал ІКК досліджували в короткочасовій 24-годинній культурі. Використовували мітоген конканавалін А (Кон A) у концентрації 5 мкг/мл. Суспензію клітин готували у концентрації 5Ч106 клітин/мл в повному живильному середовищі на основі RPMI-1640 („SIGMA", США), L-глутаміну – 300 мкл/мл, гентаміцину – 60 мкг/мл („PHARMACHIM", Болгарія), HEPES („SIGMA", США). В об'ємі 200 мкл 96-лункового плоскодонного планшету суспензію клітин інкубували з Кон A при температурі 37°С та зволоженій атмосфері з 5% СО2. Після інкубації суспензію клітин переносили до пластикових пробірок для цитометричного аналізу та проводили лізис еритроцитів з використанням Lysing Solution (BD, США).

Активаційну відповідь оцінювали за кількістю клітин, які експресують на своїй мембрані маркери активації (МА), а саме: аnti-CD25, аnti-CD71, аnti-HLA-DR, anti-CD38. Оцінка здатності лімфоцитів відповідати на мітоген проводилась за коефіцієнтом активації, який обчислювали окремо для кожного МА, як відношення відсотку клітин, які експресують МА після інкубації з мітогеном, до відсотку клітин, що експресують МА спонтанно.

Для оцінки проліферативної активності лімфоцитів використовували метод розподілення клітин за фазами клітинного циклу. Після культивування проводили пермабілізацію клітинних мембран лімфоцитів за допомогою Permeabilizing Solution (BD, США). Як наслідок – інтеркалюючий барвник пропідію йодид (PI) вільно проникає у клітини і зв'язується з ДНК. Суспензію клітин з PI у концентрації 5 мкг/мл інкубували 20 хв. у темряві. Аналіз проводили за допомогою проточної цитофлуориметрії шляхом оцінки червоного спектру флуоресценції (FL2) PI для 10000 клітин. Визначали процент гіподиплоїдних клітин (апоптотичні клітини), диплоїдних клітин (фази G0/G1) та відсоток тетраплоїдних клітин у S/G2 фазах клітинного циклу.

Визначення спонтанного та верапаміл-індукованого апоптозу проводили за допомогою системи для визначення деформацій (перебудов) клітинних мембран, що супроводжують запрограмовану клітинну загибель – Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD, США). Забарвлення проводили згідно з протоколом рекомендованого фірмою-виробником. Апоптоз також оцінювали шляхом підрахунку індексу апоптозу, який обчислювали як співвідношення анексин-V+PI- клітин до загальної кількості клітин в регіоні [Qi-Zhen Cao et al., 2005].

Для активації апоптотичних процесів використовували блокатор кальцієвих каналів верапаміл у концентрації 100 мМоль/л. Клітини ПК інкубували в загальному об'ємі 200 мкл у 96-лунковому планшеті протягом 5 годин при температурі 370С та зволоженій атмосфері з 5 % СО2. До комплексу досліджень спонтанного апоптозу входило визначення відсотку маркеру запрограмованої клітинної загибелі – CD95 (Fas-рецептор) (BD, США). Паралельно проводили внутрішньоклітинне визначення антиапоптогенних молекул Bcl-2 (BD, США). Підготовку зразків проводили за стандартною методикою для прямого імунофлуоресцентного тесту.

Первинні дані були отримані з використанням програми WinMDI 2.8. Статистичний аналіз та презентацію отриманих результатів проводили у форматі пакету для статистичної обробки даних SPSS 15.0.

Аналіз і узагальнення результатів досліджень. Проведено аналіз популяційного складу лейкоцитів ПК хворих на МДС, з використанням МКАТ до диференційних антигенів CD14 та CD45. Рівень експресії CD45 антигену знижений на клітинах гранулоцитарного ряду при всіх підтипах МДС, що в зв'язку з участю CD45 у процесах активації клітин та утворення клітин пам'яті, може розцінюватись, як прояв імунологічної недостатності. Незміненим залишається цей показник серед клітин лімфоїдного регіону. В клітинах моноцитарного ряду встановлено підвищення відсоткового вмісту CD45–14+ клітин, особливо у підгрупі хворих на РАНБ, РАНБ-Т, порівняно з контролем. Порівняльний аналіз популяційного складу ПК та КМ хворих на МДС показав при всіх варіантах значне зниження експресії CD45 антигену на клітинах лімфоїдного ряду КМ. Гранулоцити КМ у підгрупі хворих на РА, МДС-Н були представлені домінуючою популяцією з високою експресією CD45, що можна розцінювати як прояв процесів дисгранулоцитопоезу. Характерною особливістю КМ у підгрупі, яка об'єднує хворих на РАНБ, РАНБ-Т, є підвищення відсоткового вмісту CD45+14– бластних клітин порівняно із ПК, що корелює із критеріями FAB-класифікації МДС [J.M. Bennet et al., 1982]. Проведений аналіз популяційного складу ПК та КМ за показниками бокового світлорозсіяння – SSC. Зафіксована наявність популяцій гранулоцитів із зниженою гранулярністю за рахунок мієлобластів у ПК та КМ хворих на МДС. Гіпогранулярність в регіоні гранулоцитів КМ має більш виражений характер порівняно з ПК.

Застосування широкої панелі МКАТ дозволило провести дослідження експресії лінійних та диференційних антигенів у групах обстеження. При аналізі даних імунофлуоресценції визначали відсоток позитивних клітин та інтенсивність експресії досліджуваних антигенів. Проведений аналіз показав наявність порушень експресії лінійних, диференційних та активаційних антигенів клітин кровотворної системи у хворих на МДС. Вміст клітин з експресією диференційних антигенів Т-лімфоцитів, а саме CD5+, CD3+, CD7+, був стабільним. Поряд з цим показники ІФ Т-клітинних диференційних антигенів лімфоцитів були достовірно знижені. Зміни рецепторного апарату Т-клітин у хворих на МДС свідчать про функціональну недостатність цієї ланки лімфоїдного ряду і можуть бути відображенням переходу до мієлодиспластичного стану. Субпопуляційний склад ІКК характеризувався достатнім рівнем зрілих CD4+ та CD8+ лімфоцитів. Однак, спостерігається тенденція до зростання популяції CD8+ клітин у поєднанні із зниженням вмісту CD4+ клітин. Відмічено зростання CD56+ клітин у підгрупі хворих на РАНБ, РАНБ-Т та CD56+DR+ при всіх варіантах МДС. Активація гомофільної молекули міжклітинної адгезії CD56+ не виключає реципрокну депресивну дію на елементи гемопоезу шляхом зміни продукції розчинних ростових факторів. Зазначений дефект може відображати спільність механізмів дисгемопоезу, який спостерігається при МДС, а також процесів диференціювання ІКК. Поряд з цим зафіксоване зниження ІФ CD56 антигену, що пов'язано з відповідними порушеннями функціональної активності натуральних кілерів (CD56+) при всіх варіантах МДС та має особливе значення у формуванні непластичних змін гемопоезу. Однак, не можна виключити, що порушення в імунній системі – лише наслідок хвороби. З метою встановлення внеску радіаційного чинника у формування патологічних станів імунної системи у хворих на МДС, проведено аналіз субпопуляційного складу ІКК у трьох групах обстеження: групі нозологічного контролю (неопромінені хворі на МДС); хворих на МДС-УЛНА на ЧАЕС 1986 р.; УЛНА на ЧАЕС 1986 р. без гематологічних патологій. У групі нозологічного контролю спостерігали зростання кількості CD4–8+ клітин на фоні зниження CD4+8– клітин. Протилежний характер змін зафіксовано серед УЛНА на ЧАЕС та хворих на МДС з дозовим навантаженням. Виявлено негативну кореляцію між дозою опромінення та відносною кількістю Т-супресорів серед цієї категорії осіб (r = –0,634; р<0,01) і позитивний кореляційний зв'язок між дозою опромінення та вмістом Т-хелперів (r = 0,622; р<0,13). Результати проілюстровано на рис 1.

А.

Loading...

 
 

Цікаве