WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Поверхневі компоненти вірусів коксакі в та їх селекціонованих варіантів (автореферат) - Реферат

Поверхневі компоненти вірусів коксакі в та їх селекціонованих варіантів (автореферат) - Реферат

Дослідження, спрямовані на порівняльну оцінку способів контрастування, які можуть бути використані у електронній мікроскопії ентеровірусів, показали найбільшу зручність у використанні та високу ефективність крапельного способу. При застосуванні флотаційного способу спостерігалося зниження частоти виявлення ентеровірусів, проте зменшувалось кількість неспецифічних забруднювачів. Метод розпилення вірусовмісного матеріалу з контрастером не давав змоги визначити час контрастування, в результаті чого відмічалося "роз'їдання" плівки-підложки променем електронів.

При електронній мікроскопії вірусів Коксакі В, як і інших ентеровірусів, найбільша складність виникала при дослідженні матеріалу з низьким титром (нижче 7,0–6,0 lg). Для вирішення цієї проблеми було розроблено спосіб їх виявлення у матеріалі з низьким титром шляхом використання на поверхні плівок-підложок бентоніту – природного алюмосилікату з групи глинистих мінералів монтморилонітів, який має високі сорбційні властивості щодо цих вірусів (рис. 1).

Рис. 1. Віруси Коксакі В-6, сорбовані на бентоніті. Електронна мікроскопія. Збільшення 60 000.

Порівняльне вивчення структурно-морфологічних особливостей дисоціантів вірусів Коксакі В розпочинали з дослідження їх розмірів. В результаті аналізу 100 вірусних часточок із кожної групи вірусів та проведення статистичної обробки встановлено, що після концентрування розміри у бентонітових варіантів вірусів Коксакі В є однаковими і становлять: Коксакі В-6 (Абент+) – 27,90,05, Коксакі В-6 (Абент-) – 27,890,1; Коксакі В-2 (Абент+) – 28,40,1, Коксакі В-2 (Абент-) – 28,10,1.

Для виключення можливого впливу контрастеру на розміри цих вірусів, проведено їх відтінення платиною. Комп'ютерний аналіз електронограм підтвердив, що розміри дисоціантів вірусів Коксакі В-6 залишаються однаковими: Коксакі В-6 (Абент+) – 29,170,1, Коксакі В-6 (Абент-) – 29,120,1.

Наступним етапом досліджень було проведення порівняльної оцінки способів концентрування вірусів Коксакі В, направлених на виявлення у цих вірусів додаткових компонентів. Після концентрування бентонітом, поліетиленгліколем та ультрацентрифугування віріони за формою наближались до сферичних та мали діаметр близько 29 нм. Разом з тим, відмічено суттєву очистку препаратів від неспецифічних забруднювачів після концентрування бентонітом.

Слід зазначити, що вивчаючи концентровані віруси Коксакі В, нам не вдалось виявити у них додаткових структур. Зроблено припущення, що процес концентрації може звільняти ентеровіруси від "гіпотетичних" додаткових поверхневих компонентів. З метою з'ясування цього питання проведено вивчення нативних препаратів вірусів Коксакі В, тобто без застосування жодного з вищезгаданих методів обробки вірусовмісного матеріалу.

Електронно-мікроскопічні дослідження нативних ентеровірусних препаратів показали, що на поверхні вірусів Коксакі В (варіант Абент+) знаходяться додаткові компоненти з різним діаметром (2-7-10 нм), які переважно хаотично розміщуються по всій поверхні віріону (рис. 2А). На поверхні вірусів Коксакі В з низьким афінітетом до бентоніту (варіант Абент-) таких речовин виявлено не було (рис. 2Б). Очевидно, встановлені у вірусів Коксакі В-6 додаткові поверхневі структури мають клітинне походження та, можливо, представлені залишками їхніх зруйнованих мембран.

А Б

Рис. 2. Морфологія неконцентрованих бентонітових варіантів вірусів Коксакі В-6. А. Варіант Абент+. Б. Варіант Абент-. Електронна мікроскопія, збільшення 80 000.

Примітка. Стрілками показано додаткові поверхневі компоненти вірусів.

З метою орієнтовного з'ясування хімічного складу виявлених на поверхні вірусів Коксакі В (Абент+) додаткових структур, провели їх контрастування 1% осмієвою кислотою, як специфічним контрастером ліпідів. Результати електронно-мікроскопічних досліджень даних вірусів свідчать про те, що виявлені поверхневі компоненти ефективно контрастувалися не лише 1% фосфорно-вольфрамовою кислотою, яка має високу спорідненість до білкових структур, але й 1% осмієвою кислотою, яка застосовується як контрастер ліпідів (рис. 3А). Отже, не виключено, що встановлені у вірусів Коксакі В компоненти мають ліпідну природу. Вагомим підтвердженням цього є те, що обробка вірусовмісного матеріалу органічним розчинником – ефіром призводить до очищення вірусних поверхонь від додаткових компонентів (рис. 3Б).

А Б

Рис. 3. Віруси Коксакі В-6 (Абент+), після обробки ефіром (А), та без обробки ефіром (Б) контрастовані 1% осмієвою кислотою. Електронна мікроскопія, збільшення 80 000.

З метою підтвердження можливості існування саме клітинних залишків на поверхні вірусів, проведено серію експериментів, в яких до концентрованої вірусної популяції додавали суспензії клітинного детриту. В результаті цих досліджень було встановлено, що компоненти клітин приєднувалися до поверхні вірусів Коксакі В (варіант Абент+), і, у останніх при електронно-мікроскопічному дослідженні виявлялись структури, абсолютно ідентичні тим, що були встановлені у вірусів безпосередньо після репродукції (неконцентрованих та неочищених).

Разом з тим, встановлено, що додавання клітинного детриту до концентрованих вірусів Коксакі В з низькими сорбційними властивостями до бентоніту (варіант Абент-) не впливало на їх морфологію і поверхні вірусів залишалися вільними від клітинного детриту.

Дослідження впливу розчинників на деякі властивості вірусів Коксакі В. Відомо, що пікорнавіруси можуть тривалий час зберігати свою інфекційність, перебуваючи у сироватці крові з віруснейтралізуючими антитілами (Gwaltney I. et al., 1989). Раніше було показано зростання ступеня нейтралізації антитілами деяких риновирусів та ентеровірусів після обробки хлороформом (Fields B.N., 1996), встановлено зростання ефективності нейтралізації деяких ентеровірусів після обробки детергентами (Мельник В.В., 1996).

Виходячи з цього, наступним тестом на ліпідвмісні компоненти у складі ентеровірусів стало з'ясування ефективності нейтралізації вірусів Коксакі В типоспецифічними діагностичними сироватками після екстракції вірусовмісного матеріалу органічним розчинником (ефіром). В результаті було встановлено (табл. 1), що зростання ефективності нейтралізації типоспецифічними діагностичними сироватками після обробки ефіром відбувалося у вірусів Коксакі В-3 – на 36,5%, В-4 – на 75%, В-5 – на 73%, В-6 – на 79%. Менше зростала повнота нейтралізації у вихідних популяцій вірусів Коксакі В-1 та не відмічалася у вірусів Коксакі В-2.

Таблиця 1

Вплив попередньої обробки вірусів Коксакі В ефіром на результати їх нейтралізації типоспецифічними діагностичними сироватками

Віруси

Без обробки ефіром

Після обробки ефіром

Коксакі В-1

3,0?103,4

2,25?103,4

Коксакі В-2

1,25?104,6

1,25?104,6

Коксакі В-3

2,5?102,8

2,0?102,7

Коксакі В-4

5,0?103,7

1,25?103,7

Коксакі В-5

1,0?103,6

0,33?103,5

Коксакі В-6

1,25?103,5

0,33?103,4

Примітка. Титр виражений в БУО/мл (бляшкоутворюючі одиниці/мл).

Очевидно, після обробки органічними розчинниками, антигенні ділянки вірусів з вираженим афінітетом до бентоніту (варіант Абент+) стають більш "відкритими" та доступними до дії антитіл, що проявляється у зростанні ступеня їх нейтралізації.

Порівняльне дослідження факторів, які впливають на збереження інфекційності вірусів Коксакі В та їх дисоціантів у лабораторних умовах. Для з'ясування можливої протекторної (захисної) функції виявлених у вірусів Коксакі В додаткових компонентів, проведено дослідження динаміки інактивації вірусів Коксакі В у середовищі, не звільненому від залишків клітин (табл. 2).

Loading...

 
 

Цікаве