WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Поверхневі компоненти вірусів коксакі в та їх селекціонованих варіантів (автореферат) - Реферат

Поверхневі компоненти вірусів коксакі в та їх селекціонованих варіантів (автореферат) - Реферат

Вперше показано диференціацію бентонітових варіантів вірусів Коксакі В за здатністю до агрегації та встановлено залежність даних властивостей вірусів від рН середовища: варіант Абент+ у більшості агрегує при кислих значеннях рН, на відміну від варіанту Абент-, який здатен до агрегації як при кислих, нейтральних, так і при слаболужних рН.

Практичне значення одержаних результатів. Вдосконалено методику сублімаційного висушування ентеровірусів шляхом їх попередньої сорбції на природному алюмосилікаті (бентоніті) з наступним додаванням інших складових захисного середовища. Визначено умови, при яких можливо отримання сублімаційно висушених ентеровірусних препаратів з більш тривалим терміном збереження інфекційності.

Розроблено спосіб електронно-мікроскопічного виявлення ентеровірусів у вірусовмісному матеріалі з низьким титром при використанні плівок-підложок, оброблених бентонітом.

Особистий внесок здобувача. У дисертації викладені результати теоретичних та експериментальних досліджень, проведених переважно особисто. Здобувачем самостійно проведеноінформаційно-патентний пошук та аналіз наукової літератури за темою дисертації, підбір методик дослідження, їх виконання та аналіз одержаних результатів.

Дослідником самостійно проведено порівняльний аналіз контрастерів, способів контрастування та концентрування ентеровірусів, визначено оптимальні методичні підходи до електронно-мікроскопічного дослідження цих біологічних об'єктів, власноруч селекціоновано бентонітові варіанти (Абент+ та Абент-) усіх серотипів вірусів Коксакі В. Здобувачем самостійно здійснено порівняльний аналіз захисних середовищ для ліофілізації вірусів Коксакі В.

Всі положення та висновки дисертаційної роботи належать автору. Всі розділи дисертації та публікації за темою дисертації написані автором під керівництвом академіка НАН України, професора Широбокова В.П.

Всі положення та висновки дисертаційної роботи належать автору. Автор приймав безпосередню участь у написанні та аналізі друкованих за темою дисертації робіт.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що викладені в дисертаційній роботі, були представлені на науково-практичній конференції, присвяченій пам'яті академіка Л.В. Громашевського (Київ, 11-12 листопада 2004 р.), VII Міжнародній науково-практичній конференції "Наука і освіта 2005" (Дніпропетровськ, 17-21 лютого 2005 р.), 59-й науково-практичній конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету імені О.О. Богомольця з міжнародною участю "Актуальні проблеми сучасної медицини" (Київ, 6-8 квітня 2005 р.), міжнародній науковій конференції, присвяченій 160-літтю з дня народження лауреата Нобелівської премії І.І. Мечнікова "Актуальні питання боротьби з інфекційними захворюваннями в гуманній та ветеринарній медицині" (Харків, 27-29 листопада 2005 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано десять наукових праць, з яких 4 статті у фахових виданнях, визначених ВАК України, 4 – у збірниках наукових праць, матеріалах конференцій, отримано 2 патенти на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, 3 експериментальних розділів, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків та списку використаних джерел. Робота викладена на 142 сторінках, містить 15 таблиць, 22 рисунки. Список використаних джерел містить 257 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Віруси: використані прототипні штами вірусів Коксакі В, одержані з Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів імені М.П. Чумакова РАМН, а саме, Коксакі В-1 (штам Connecticut-5); Коксакі В-2 (штам Ohio-1); Коксакі В-3 (штам Nancy); Коксакі В-4 (штам Powers); Коксакі В-5 (штам Faulkner); Коксакі В-6 (штам Hammon).

Тварини: у дослідах були використані мишенята лінії BALB/c 1-3 денного віку.

Культури клітин: для накопичення і титрування поліовірусів та постановки реакції віруснейтралізації використовували перещеплювані культури клітин лінії НЕр-2 (з клітин карциноми гортані людини), Vero (клітини нирки африканських зелених мавп) та Неlа (клітини карциноми шийки матки людини).

Перещеплювані клітини культивували на середовищі DМЕМ "Sigma" з додаванням 7-8% ембріональної телячої сироватки (ЕТС), пеніциліну та стрептоміцину. Пасаж вірусів проводили за загальноприйнятими методами, інфікуючи моношари клітин. Селекцію бентонітових варіантів здійснювали за методом академіка Широбокова В.П.,1977.

Концентрування вірусів проводили бентонітом, поліетиленгліколем та ультрацентрифугуванням.

Титр вірусів визначали двома способами: мікрометодом за ЦПД та за бляшкоутворенням під бентонітовим покриттям (Широбоков В.П., 1977).

Дослідження впливу органічних розчинників на нейтралізацію ентеровірусів типоспецифічними імунними сироватками здійснювали наступними чином: вірусовмісний матеріал змішували з ефіром чи хлороформом у співвідношенні 1:1 та залишали в пробірці під ватно-марлевою пробкою на ніч при +4?С, далі вилучали вірусовмісну водну фазу. Розведену від 10-1 до 10-7 вірусовмісну рідину змішували з типоспецифічною імунною сироваткою робочого розведення та виявляли так званий, "поріг нейтралізації", тобто те розведення, де ще не спостерігалась цитопатична дія вірусів. Далі концентрацію вірусовмісної рідини, яка на один логарифм менша від тієї, що відповідає порогу нейтралізації, розводили з кроком розведення 0,1 lg. Отриманими розведеннями інфікували клітинні моношари, вирощені у колбочках Ерленмейєра та заливали їх бентонітовим поживним покриттям. Результати даної реакції оцінювали через 48 годин в БУО/мл.

Дослідження структурно-морфологічних особливостей бентонітових варіантів вірусів Коксакі В проводили за допомогою електронного мікроскопу ЕМ-125К та комп'ютерного аналізу отриманих знімків, використовуючи збільшення 40 000-100 000.

Плівки-підложки готували із формвару та колодію, їх укріплення здійснювали шляхом напилювання вуглецю в вакуумі. В окремих випадках, для отримання високоякісних знімків, готували, так звані, "перфоровані" плівки-підложки. В якості контрастерів використовували 1-2% розчин фосфорно-вольфрамової кислоти, 1% розчин уранілацетату, 1% розчин осмієвої кислоти.

З метою отримання максимально можливого об'ємного зображення вірусів, підвищення роздільної здатності електронного мікроскопу та вивчення деталей вірусних поверхонь застосовували метод косого напилення (відтінення) вірусів у вакуумному універсальному посту (ВУП-5).

Сублімаційне висушування вірусів здійснювали у комплексі замороження-висушування біологічних об'єктів КЗВ 9. Охолоджувачем слугував рідкий азот. В якості захисного середовища використовували 10% знежирене молоко, 7% сахарозу, 2-3% пептон, 1-3% гідролізат лактальбуміну, сироватку новонароджених телят (Sigma), 5% гель бентоніту, яєчний порошок, Mg2+ до концентрації 0,001 М. До всіх проб додавали два антибіотики: пеніцилін 100-150 МО/мл та стрептоміцин 100 мкг/мл.

Методи статистичної обробки отриманих результатів. Отримані кількісні результати досліджень оброблені загальноприйнятими методами варіаційної і кореляційної статистики з використанням значень середньої арифметичної (М), середньої похибки середньої арифметичної (m), квадратичного відхилення (у), достовірності результатів досліджень (t), достовірності результатів двох серій досліджень (р). Застосовували ПК типу ІВМ (PENTIUM-4) з використанням пакету програм фірми Microsoft.

Результати досліджень та їх обговорення. Порівняльне дослідження структурно-морфологічних особливостей вірусів Коксакі В та їх дисоціантів. Просвічуюча електронна мікроскопія вірусів на основі методу негативного контрастування широко застосовується для аналізу різного роду біологічних об'єктів. Проте, виявлення можливих додаткових поверхневих компонентів у ентеровірусів потребує підбору оптимальних контрастуючих речовин, відпрацювання існуючих та розробки нових способів їх контрастування та відтінення.

Проведений порівняльний аналіз контрастерів, які використовуються для електронно-мікроскопічних досліджень ентеровірусів, показав найбільшу ефективність 1-2% розчину фосфорно-вольфрамової кислоти (ФВК) з рН 6,0-6,5. При використанні в якості "електронних барвників" таких речовин, як 1-2% розчин фосфорно-молібденової кислоти, 2% розчин уранілацетату, 0,59 М розчин оцтовокислого свинцю, відмічено наступні, характерні для усіх них, недоліки. По-перше, виражена нерівномірність контрастування вірусів, тобто в одному полі зору відмічаються як недоконтрастовані так і високо контрастні вірусні часточки. По-друге, часто відмічається втрата міцності плівки-підложки. По-третє, виникнення зернистості зображення, особливо на великих збільшеннях електронного мікроскопу.

Loading...

 
 

Цікаве