WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Розробка лабораторного регламенту культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу класичної чуми свиней (автореферат) - Реферат

Розробка лабораторного регламенту культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу класичної чуми свиней (автореферат) - Реферат

Залежність вивчали на клітинних культурах ТЯ та SК-6. Досліджували вплив вмісту сироватки вівці у підтримуючому середовищі ГЛА + RPMI на врожайність зазначеного вище вірусу. Клітинні культури були вирощені у вигляді моношару в пластикових матрасах об'ємом 50см3. Зараження здійснювали штамом ЛК-М вірусу КЧС 1БУО / кл. Підтримуюче середовищеконтрольних зразків являло собою комбінацію ГЛА + RPMI (без сироватки), підтримуюче середовище для дослідних зразків містило сироватку крові вівці у різній концентрації : 2%,4% та 8 %.

Інкубацію здійснювали при температурі 370С протягом 96 годин, потім визначали інфекційний титр вірусу за допомогою цитохімічного варіанту ІФА.Результати цих дослідів представлені у таблиці 6.

Таблиця 6 - Результати визначення титру вірусу КЧС (штаму ЛК-М) у заражених клітинних культурах ТЯ та SК-6 при використанні різного за складом підтримуючого середовища

Як свідчать результати досліджень, наявність сироватки у підтримуючому середовищі помітно сприяє підвищенню врожайності штаму ЛК-М вірусу КЧС (Р < 0,05).

Оскільки вміст сироватки понад 2 % не впливає на подальше зростання врожайності вірусу, було вирішено використовувати підтримуюче середовище з додаванням 2 % сироватки.

Відомим у вірусологічній практиці прийомом, що дає змогу отримувати більш концентровані вірусні матеріали та суттєво економити живильне середовище, є ролерне культивування. Результати визначення ефективності останнього під час культивування штаму ЛК-М вірусу КЧС представлені у таблиці 7.

Таблиця 7 - Титр вірусу КЧС (штаму ЛК-М) у заражених клітинних культурах ТЯ та SК-6 при стаціонарному та ролерному культивуванні

Як свідчать наведені у таблиці 7 дані, ролерне культивування забезпечує закономірно вищу концентрацію штаму ЛК-М вірусу КЧС (Р<0,05).

Вплив вакцинного штаму вірусу КЧС на деякі показники гуморального та клітинного імунітету у свиней вивчали на поросятах неплемінного походження, віковий діапазон яких був 3-4 місяці з масою тіла 30-40 кг.

Як показали результати дослідження, кількість еритроцитів у тварин після введення їм вакцини ЛК-М коливалась невірогідно (Р> 0,05). Кількість лейкоцитів периферійної крові у свиней дослідної групи вірогідно знизилася на сьому добу експерименту й становила 8,9 0,32 Г/л, що на 2,6 Г/л було нижчим за показник контролю на даний період дослідження та 2,4 Г/л – за відповідний показник на третю добу експерименту (Р< 0,01). Така ж тенденція спостерігалася і на 14-ту добу від початку дослідження.

Коливання відносної кількості моноцитів спостерігалося у свиней обох груп, проте були невірогідними (Р > 0,05).

Максимальний відносний вміст лімфоцитів у свиней дослідної групи встановлений на 14-ту добу досліду і становив 51,2 2,56 %, проте найвища абсолютна їх кількість була на сьому добу після введення вакцини і становила 5,02 0,393 Г/л, що вірогідно, на 0,44 Г/л, перевищувало відповідний показник контролю (Р< 0,01). На 14-ту добу цей показник у тварин дослідної групи дещо знизився, але залишався вищим за відповідні дані контролю (Р < 0,01).

Абсолютна кількість Т-клітин набула максимального значення на третю добу від початку дослідження і становила 2,75 0,299 Г/л, вірогідно – на 0,28 Г/л перевищуючи дані контролю (Р < 0,01). У подальші строки дослідження спостерігалося поступове вірогідне зниження кількості Т-лімфоцитів (Р < 0,01). Поступове вірогідне зниження кількості В-клітин порівняно із показниками до початку досліджень – до 0,89 Г/л (Р< 0,01)

спостерігалося до сьомої доби експерименту, проте на 14-ту добу відзначене її суттєве зростання – до 1,15 Г/л. Рис.3. Абсолютна кількість Т-лімфоцитів (Г/л) у свиней на різних етапах дослідження

Спостерігалось суттєве зниження абсолютної кількості О-клітин на 14 - ту добу дослідження (на 0,26 Г/л порівняно з показниками до введення вакцини та на 0,31 Г/л порівняно з показником на сьому добу експерименту).

Дослідження Т-теофілінрезистентних клітин показало, що кількість лімфоцитів даної субпопуляції набула максимального значення на третю добу експерименту і становила 1,99 0,214 Г/л, що, проте, невірогідно перевищувало відповідні дані до початку досліду (Р > 0,05) та вірогідно, на 0,2 Г/л – відповідні показники на 14-й день з моменту введення вакцини (Р< 0,01).

Кількість Т-теофілінчутливих клітин набула максимального значення на третю добу експерименту – 0,66 0,095 Г/л, проте, коливання даного показника у тварин дослідної групи виявилося невірогідним (Р > 0,05).

Дослідження не виявило вірогідного впливу вакцини ЛК-М на фагоцитарну активність нейтрофілів (Р > 0,05).

Серед змін біохімічних показників сироватки крові вакцинованих свиней відзначено вірогідне зростання загального вмісту глобулінів на 14-ту добу експерименту, причому цей показник вірогідно перевищував відповідні дані до введення вакцини на 10,47 %, а дані тварин контрольної групи – на 9,57 % (Р < 0,01; Р < 0,001).

Вміст ?-глобулінів протягом дослідження не змінювався вірогідно, проте відзначено певне зростання вмісту ?-глобулінів на третю та 14-ту добу експерименту ( рис. 4 ).

Рис. 4.Вміст глобулінів у сироватці крові вакцинованих свиней, %

Максимального значення вміст ?-глобулінів у свиней дослідної групи набув на 14-ту добу після введення вакцини і становив 19,39 2,899 %, що вірогідно перевищувало відповідні дані до введення вакцини та відповідні показники контролю – на 8,88 та 10,13 % (Р< 0,01).

На основі розробленої методики культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС було виготовлено 24 серії вірусвакцини. Препарат виявився ареактогенним та імуногенним. При вивченні імуногенності його на поросятах 3,5-4 - місячного віку було визначено, що в 1см3 міститься до 100 тисяч протективних доз. Цей показник вищий від препаратів, які виробляються в Україні.

Висновки

  1. Експериментально обґрунтовано методику культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС в гетерологічній клітинній культурі, отриманій з тканини тестикул ягнят, яка забезпечує інтенсивну репродукцію вірусу зі збереженням достатнього рівня його імуногенних властивостей.

  2. Отримано перещеплювальну клітинну культуру з тестикул ягнят, чутливу до вірусу КЧС, Ауєскі.

  3. Розроблено гістохімічний варіант непрямого імуноферментного аналізу, який дає змогу виявляти та титрувати вірус КЧС у клітинних культурах.

  4. Оптимізовано методику отримання первиннотрипсинізованих клітинних культур з тестикул ягнят та козлят, які забезпечують високий врожай клітин.

  5. Оптимізовано методику культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС у первиннотрипсинізованій клітинній культурі ТЯ та перещеплювальній КК SK-6, яка забезпечує стабільно високу його врожайність. Оптимальна інфікуючи доза вірусу становила 1 БУО/кл.

  6. Встановлено що на врожайність штаму ЛК-М вірусу КЧС впливає доза зараження, вміст трипсину в підтримуючому середовищі, якість підтримуючого живильного середовища та умови культивування. Процедура "адсорбції" та "відмивання" не змінюють інфекційного титру вірусу. Трипсин у концентрації 0,002% у підтримуючому живильному середовищі сприяє закономірному підвищенню інтенсивності репродукції вірусу КЧС . Титр вірусу зростає на 1.0lg БУО/см3 (Р<0,05).

  7. Встановлено оптимальну інфікуючу дозу - 1БУО/клітину (Р<0,05) та експозицію інкубації заражених клітинних культур штамом ЛК-М вірусу КЧС-108-132 години.

  8. Охарактеризовано імуногенну активність штаму ЛК-М вірусу КЧС, репродукованого у первиннотрипсинізованій культурі клітин ТЯ. Поросята віком 2-4 місяці, яким було введено даний штам вірусу, не захворіли на КЧС при експериментальному зараженні вірулентним штамом збудника КЧС (шт. Ші-Минь) у дозі 4 lg ЛД50.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

  1. Для промислового напрацювання вірусного матеріалу в умовах біофабрики рекомендуємо з цією метою використовувати ролерні установки .

  2. Нагромадження антигену ВКЧС штаму ЛК – М здійснювати на перещеплювальних або первинних культурах овечого або козячого походження , вільних від контамінації пестивірусами.

  3. Періодично - через два-три пасажі - перевіряти перещеплювальну культуру на предмет контамінації пестивірусами та сторонньою мікрофлорою, а первинну культуру клітин додатково до вищезазначеного, в таких самих інтервалах повністю поновлювати, запобігаючи небажаній втраті чутливості.

  4. Тестування напрацьованого вірусного матеріалу здійснювати на перещеплювальних культурах клітин свинячого походження з метою більшої достовірності показників інфекційної активності на клітинах господаря вірусу, а також для кращої наглядності в мікроскопічному дослідженні.

  5. Сироватку для культивування клітин отримувати в літньо - осінній період від будь-яких ссавців, за винятком ВРХ та тварин, які мали з ними безпосередній контакт, і відразу перевіряти на предмет присутності віруснейтралізуючих антитіл до пестивірусів у реакції нейтралізації.

  6. Відбір тестикулярної тканини проводити від клінічно здорових донорів у господарствах, вільних від інфекційних хвороб.

  7. Кастрацію тварин виконувати закритим методом, а отриманий матеріал поміщати в ростове середовище, аналогічне тому, на якому далі відбуватиметься культивування клітин.

Список опублікованих наукових праць

1. Білоконь В.І. Удосконалення методів культивування вірусу класичної чуми свиней ( штаму ЛК-М )//Ветеринарна біотехнологія. Бюлетень. - №6. - 2005. –С.50-53.

2. Білоконь В.І. Вплив трипсину на врожайність вірусу класичної чуми свиней у первиннотрипсинізованій культурі клітин тестикулярної тканини баранчиків // Науковий вісник НАУ.- №75.-2004.- С.13-15.

3. Вергун Л.Ю., Собко Ю.А.,Білоконь В.І. Імунопероксидазний метод для виявлення вірусу класичної чуми свиней та визначення антитіл до нього в сироватці крові тварин // Науковий вісник НАУ. - №16. –1999. –С. 27 – 29. (проведені науково-практичні дослідження по підбору методики культивування вірусу КЧС у клітинних культурах, які використовуються при тестуванні вірусу і антисироваток до нього).

Loading...

 
 

Цікаве