WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Розробка лабораторного регламенту культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу класичної чуми свиней (автореферат) - Реферат

Розробка лабораторного регламенту культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу класичної чуми свиней (автореферат) - Реферат

У процесі виконання роботи були використані штами вірусів, первинні й перещеплювальні клітинні культури, різні види тварин: свині, вівці, кози.

Штамивірусу КЧС : штам ЛК-М – вакцинний, отриманий в умовах НВП "Біо-Тест-Лабораторія" ( за нашою участю) методом клонування вакцинного штаму ЛК-ВНДІВІМ, адаптований до КК ТЯ (депонований у Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів, м. Київ);

  • штам Ші – Минь, одержаний у Центрі з вивчення особливо небезпечних хвороб тварин (м. Житомир), вірулентний для свиней різного віку при парентеральному зараженні.

Клітинні культури (КК): постійні лінії клітин РК-15 та SK-6 ( одержані з банку клітинних культур НВП "Біо-Тест-Лабораторія"), адаптовані до живильних середовищ вітчизняного виробництва: ГЛА, RPMI. Зберігаються у замороженому стані (- 196 0 С);

первиннотрипсинізована клітинна культура з тканин тестикул ягнят, отримана за загальноприйнятою методикою та власною модифікацією ряду елементів.

Сировиною для отримання первиннотрипсинізованої КК ТЯ були тестикули ягнят. В умовах господарства відбирали баранчиків віком 1 – 4 місяці й кастрували їх закритим способом. Тестикули із загальною піхвовою оболонкою поміщали в склянку з підтримуючим середовищем RРМІ – 1640, охолодженим до 4 0 С, яке містило антибіотики - стрептоміцину сульфат 2 мг/см3 та бензил-пеніциліну 2000 ОД / см3. Матеріал транспортували в лабораторію і відразу ж піддавали трипсинізації.

Трипсинізацію здійснювали при різних температурних режимах (40С, 200С та 370С). Використовували стандартний 0,25%-ний розчин трипсину. Під час трипсинізації у флакон із шматочками тканини почергово вносили трипсин та живильне середовище RPMI без сироватки крові. Така модифікація забезпечувала стабільний позитивний результат під час отримання клітинної культури з тканин тестикул ( наша модифікація ).

Після підрахунку кількості живих клітин одержували суспензію на ростовому живильному середовищі (ГЛА / RPMI 50 / 50 з 10 % сироватки крові вівці), додавали зазначене живильне середовище з таким розрахунком, щоб концентрація клітин становила 200 тис./ см3, та висівали в скляні або пластикові матраси, ролерні флакони, 96 – лункові планшети фірми SARSTED (залежно від потреб). Інкубували в стаціонарних та ролерних умовах (1-2об./хв) при температурі 370 С. Стан формування моношару клітин визначали візуально та за допомогою інвертованого мікроскопа Оpton – ID – 02.

Зараження клітинних культур здійснювали за загальноприйнятим методом і різноманітними модифікаціями. У першому випадку живильне середовище зливали, у кожний матрас з культурою вносили вірусвмісну рідину, яку розподіляли по всьому моношару клітин. Адсорбцію здійснювали протягом 30-45 хвилин при кімнатній температурі (18-250С), після чого вносили живильне середовище (ГЛА або Ігла на основі ФГМ-С з 4 % сироватки вівці або ягнят, рН 7,5-7,6).

Заражені клітинні культури інкубували протягом 4 - 5 діб у термостаті при температурі 370С. Титр вірусу визначали за допомогою розробленого нами гістохімічного варіанту ІФА.

У зв'язку з пошуком методу зараження клітинних культур, який забезпечував би належну врожайність вірусного штаму та був достатньо технологічним, паралельно з описаним методом, проводили зараження за різними варіантами :

  • з попереднім відмиванням моношару та без відмивання;

  • з використанням процедури "адсорбція" вірусу та шляхом безпосереднього внесення вірусу в ростове живильне середовище.

Досліджували також вплив інших елементів на врожайність вірусу: інфікуючої дози, присутності трипсину у підтримуючому середовищі, експозиції культивування.

Кров від свиней відбирали за методикою У. Ерфле з співавторами (1987 р.).

Постановку гістохімічного варіанту імунопероксидазного методу здійснювали в пластикових планшетах фірми SARSTED. Використовували імунопероксидазний кон'югат власного приготування. Специфічну щодо збудника КЧС сироватку отримували на свинях, пероксидазу одержували від фірми SEGMA. Кон'югацію проводили за власною методикою. Результати постановки ІФА визначали візуально.

Постановку реакції інгібіції міграції лейкоцитів здійснювали за методикою, описаною Г. Фримелем (1987), у якості клітин-мішеней використовували лейкоцити селезінки мишей.

Перещеплювальну клітинну культуру ТЯ отримували на основі первиннотрипсинізованої клітинної культури ТЯ шляхом клонування та тривалого пасажування in vitro.

Достовірність результатів досліджень визначали шляхом статистичного опрацювання отриманих цифрових даних за програмою "Біом-3".

Результати власних досліджень

Використовуючи загальновідомий принцип отримання первинно-трипсинізованих клітинних культур та запровадивши ряд власних модифікацій, нам вдалось розробити методику отримання первинно-трипсинізованої клітинної культури з тканин тестикул баранчиків і козлят. Клітини обох культур мали епітеліоподібний вигляд, формували якісний моношар протягом 3-4–х діб. Останній, за оптимальних умов, залишався без видимих деструктивних явищ протягом 10-14–ти діб.

Шляхом клонування та опромінення (0,5 мегарад) під час тривалого пасажування клітинної культури ТЯ, була отримана постійна клітинна лінія (перещеплювальна) ТЯ. За чутливістю та здатністю забезпечувати належну репродукцію вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС вона не поступається відповідній первиннотрипсинізованій клітинній культурі.

Орієнтуючись на відомі дослідження, що стосуються суті гістохімічних варіантів детекції патогенів, нами була розроблена методика виявлення вірусу КЧС у клітинних культурах та інших біологічних (патологічних) матеріалах, яка грунтується на гістохімічному варіанті ІФА. В процесі її розробки шляхом гіперімунізації кіз були одержані антивидові (проти імуноглобулінів свині) імуноглобуліни, отримані на їх основі імунопероксидазні кон'югати, оптимізовані всі етапи постановки гістохімічного варіанту ІФА та під час виявлення збудника КЧС ( чи його компонентів) у клітинних культурах. В таблиці 1 представлені результати титрування вірусу КЧС за допомогою розробленого нами гістохімічного варіанту ІФА та методу імунофлуоресціюючих антитіл.

Таблиця 1 - Порівняльне титрування вірусу КЧС ( штам ЛК-М) у клітинних культурах ТЯ і SК-6, визначені різними методами

Як свідчать вищенаведені дані, показники титру вірусу КЧС при застосуванні гістохімічного варіанту ІФА суттєво перевищували показники титру, визначені за допомогою ІФА (Р<0,05). Останній, крім того, надзвичайно громіздкий, потребує серйозного інструментального забезпечення, врахування результатів вимагає великого досвіду й надмірної зорової напруги, що послужило підставою віддати перевагу цитохімічному варіанту ІФА, підготувати та затвердити методичні рекомендації, користуватись ними в процесі оптимізації культивування вакцинного штаму вірусу КЧС і внести його в регламент виробництва вакцини проти КЧС.

Зважаючи на важливість інфікуючої дози вірусів у процесі їх культивування, ми здійснили ряд експериментів на клітинних культурах ТЯ та SK-6, заражаючи їх різними інфікуючими дозами штаму ЛК-М вірусу КЧС, з розрахунку на одну клітину. Титри вірусу визначали за допомогою гістохімічного варіанту ІФА та виражали їх у бляшкоутворюючих одиницях (БУО ; табл. 2,3).

Таблиця 2 - Інфекційний титр вірусу КЧС (штам ЛК-М) у клітинній культурі ТЯ в залежності від дози зараження (БУО)

Як видно з представлених у таблицях даних, найвищу врожайність вірусу вакцинного штаму ЛК- М спостерігали тоді, коли доза зараження становила 1 БУО /кл. (Р<0,05).

Результати визначення впливу трипсину на врожайність штаму ЛК-М вірусу КЧСпредставлені в таблиці 4.

Таблиця 4 - Вплив трипсину на врожайність вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС у клітинній культурі ТЯ

Наведені в таблиці та представлені на гістограмі (рис1) дані свідчать про те, що вміст трипсину у підтримуючому живильному середовищі в кількості 0,002 % сприяє підвищенню врожайності вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС в процесі репродукції його у первиннотрипсинізованій клітинній культурі (Р< 0,05).

Рис. 1.Вплив трипсину на врожайність вірусу КЧС штаму ЛК – М

Важливим елементом характеристики вірусної інфекції чутливої біологічної вірусної системи є, як відомо, необхідність ретельного дослідження динаміки накопичення вірусу. Особливого значення останнє набуває при розробці оптимальної технології отримання відповідного вірусного матеріалу.

Динаміка накопичення вакцинного штаму ЛК –М вірусу КЧС у клітинних культурах ТЯ та SК –6

У серії лабораторних експериментів клітинні культури вирощували в пластикових матрасах об'ємом 50 см3. Після формування моношару клітини заражали попередньо визначеною оптимальною дозою вірусу (1 БУО / кл.).

Заражені клітинні культури інкубували при 370С та досліджували через 84, 108, 132 і 156 годин за допомогою цитохімічного варіанту ІФА. Результати цих досліджень наведені у таблиці 5 та на гістограмі (рис.2).

Таким чином, представлені у таблиці 5 та на вищенаведеній гістограмі результати досліджень свідчать, що найбільш високий титр штаму ЛК-М вірусу КЧС мав місце в період із 108 -ї по 132-гу годину після зараження.

Таблиця 5 - Результати визначення інфекційної активності (титру вірусу КЧС шт. ЛК-М ), отриманих у різний період після зараження клітинних культур ТЯ та SK – 6

Рис. 2.Титр інфекційної активності ВКЧС у культурі ТЯ у різний період після зараження

Залежність інтенсивності репродукції вірусу КЧС ( штам ЛК-М) від характеру підтримуючого середовища

Loading...

 
 

Цікаве