WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну (автореферат) - Реферат

Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну (автореферат) - Реферат

Таким чином, установлено, що 2-антиплазмін регулює швидкість гідролізу фібрину на стадії активації плазміногену тканинним активатором.

Механізм зміни активності плазміну в комплексі зі стрептокіназою.

Плазмін, крім фібринолітичної, виконує в організмі різноманітні регуляторні функції. Вибірково гідролізуючи в білках певні пептидні зв'язки, він активує металопротеїнази, фактори росту, клітинні рецептори. В зв'язку з багатофункціональністю та участю плазміну в широкому спектрі біологічних процесів, особливого значення набуває вивчення механізмів регуляції активності плазміну на рівні білок-білкових взаємодій.

Одним з відомих білків, які змінюють активність плазміну, є стрептокіназа. В комплексі з нею плазмін не інгібується 2-антиплазміном, майже втрачає здатність гідролізувати фібрин і стає ефективним активатором плазміногену.

Ми поставили на меті з'ясувати механізм регуляції активності плазміну по відношенню до високомолекулярних субстратів та інгібіторів в комплексі з стрептокіназою.

Оскільки взаємодія 2-антиплазміну і стрептокінази з плазмін(оген)ом є багатоцентровою і відбувається за участі як кринглових, так і протеїназного доменів ферменту, порівнювали зв'язування цих білків, що попередньо мітили біотином, з іммобілізованими фрагментами плазміногену.

Обидва білка в однаковій кількості і з однаковою спорідненістю (С50 дорівнює 60-80 нМ) зв'язуються з кринглом 1-3. Тоді як стрептокіназа проявляє більш високу спорідненість до міні-плазміногену (С50 – 26 нМ), з яким зв'язується в основному в області протеїназного домену, оскільки на величину зв'язування слабо впливає 20 мМ аргінін, який блокує ділянку п'ятого крингла.

Стрептокіназа, в залежності від концентрації, інгібує зв'язування 2-антиплазміну з плазміном. Повне інгібування спостерігається за одночасної присутності стрептокінази та 6-АГК (рис. 13). За аналогічних умов 2- антиплазмін та 6-АГК слабо впливають на зв'язування стрептокінази з

плазміном. Зроблено висновок, що взаємодія 2-антиплазміну саме з протеїназним доменом блокується стрептокіназою. Послаблення впливу стрептокінази на взаємодію 2-антиплазміну з плазміном за інгібування ферменту ДФФ, вказує, що ділянки зв'язування стрептокінази розташовані поблизу або в контактній зоні активного центра.

Отримані результати добре узгоджуються з даними рентгеноструктурного аналізу комплексу мікро-плазмін–стрептокіназа, які показали, що область активного центра ферменту оточена розташованими на поверхні кластерами позитивно заряджених амінокислот, що беруть участь у взаємодії з стрептокіназою (Parry, 2000).

Дослідження просторової структури мікро-плазміну та активаторів плазміногену виявили, що поблизу активного центра плазміну розташована виступаюча назовні петля, яка має делецію з 6 амінокислотних залишків і є більш пологою порівняно з аналогічною структурою тканинного активатора та урокінази. Внаслідок цього плазмін гідролізує пептидні зв'язки, розташовані на витягнутих в просторі ділянках поліпептидного ланцюга, тоді як активатори – на ділянках, що мають "шпилькоподібну" структуру.

Результати експериментальних досліджень та аналіз літературних даних дозволили запропоновувати механізм регуляції активності плазміну в комплексі з стрептокіназою. Він полягає в тому, що частина молекули стрептокінази, що приєднується до протеїназного домену, виконує структурну роль відрізка поліпептидного ланцюга, де має місце делеція амінокислотних залишків. В такий спосіб стрептокіназа обмежує доступ в контактну зону активного центра плазміну просторово витягнутим субстратам та інгібіторам і залишає її відкритою для субстратів, які мають ділянки, структурно подібні до активаційної петлі плазміногену.

Кількісне визначення основних компонентів фібринолітичної системи в плазмі крові. Фібринолітична система, що регулює утворення та лізис фібринових згустків, відіграє важливу роль в підтримці гемостатичного балансу в організмі. Тому визначення рівня та активності окремих її компонентів як факторів, що сприяють та супроводжують розвиток патологічних процесів, є надзвичайно важливим для розуміння механізмів, які порушують динамічну рівновагу між зсідаючою та фібринолітичною системами крові.

Відомо, що патологічні процеси в організмі супроводжуються порушеннями зсідаючої та фібринолітичної систем крові. В зв'язку з цим визначення основних компонентів обох систем буде сприяти попередженню розвитку патологічних станів, що ведуть до тромбоутворення або геморагій, а в разі їх розвитку – визначенню схем ефективного лікування.

Широке впровадження в клінічну практику тромболітичної терапії порушує питання про необхідність контролю за зміною концентрації та активності основних компонентів, що приймають участь в процесі розчинення тромбів.

Для визначення вмісту плазміногену в плазмі найчастіше використовують імуноферментний та амідолітичний методи. Перший дозволяє визначати кількість плазміногену та його фрагментів, але не дає уявлення про рівень функціонально активного білка. Амідолітичний метод з використанням синтетичного хромогенного субстрату дає завищення рівня функціонально активного плазміногену. За різних запальних процесів поява в плазмі нейтрофільної еластази та інших протеолітичних ферментів, приводить до розщеплення циркулюючого плазміногену на декілька проміжних форм та фрагментів. Відповідні форми плазміну зберігають гідролітичну активність до хромогенних пептидних субстратів, але різко зменшують здатність розпізнавати та гідролізувати фізіологічний субстрат фібрин. До того ж в амідолітичному методі для запобігання інактивації плазміну, що утворюється, б2-антиплазміном активацію плазміногену проводять надлишковою кількістю стрептокінази. Тому весь плазмін буде находитись в комплексі з стрептокіназою, яка значно підвищує його амідолітичну активність.

За надмірної активації плазміногену рівень б2-антиплазміну крові критично знижується, що передбачає можливість неконтрольованого протеолізу і ставить питання про необхідність визначення крнцентрації б2-антиплазміну за різних патологій та при тромболітичній терапії стрептокіназою або тканинним активатором.

Концентрація тканинного активатора в крові є значно нижчою, порівняно з іншими протеазами, тому точне визначення її є методично складною задачею. Використання імуноферментних методів виявило збільшення концентрації активатора за ряду тромботичних ускладнень, що пояснюється накопиченням неактивного комплексу активатора з його специфічним інгібітором. В зв'язку з цим поряд з імуноферментними необхідно використання методів визначення функціонально активного тканинного активатора, який міг би з високою ефективністю перетворювати плазміноген до плазміну на поверхні фібринового згустка. Широкого застосування набув метод з використанням хромогенного субстрату плазміну та бромціанового фрагмента фібрину – FCB-2 в якості стимулятора. Ефекторні властивості цього фрагменту, порівняно з фібрином, є досить низькими, тому метод потребує використання високих концентрацій плазміногену. Отже, потреба у розробці способів визначення основних компонентів фібринолітичної системи з використанням специфічного фізіологічного субстрату – фібрину є нагальною практичною проблемою.

Для визначення концентрації плазміногену в плазмі крові нами розроблено спосіб, який базується на активації проферменту, адсорбованого на фібрині, каталітичною кількістю стрептокінази і гідролізі фібрину плазміном, що утворюється.

При розробці способу враховували отримані нами дані про кількість Глу-плазміногену, що зв'язується з фібрином; більш високу спорідненість нативної форми проферменту до фібрину, порівняно з стрептокіназою та б2-антиплазміном; високу швидкість активації асоційованого з фібрином Глу-плазміногену стрептокіназою та відомий факт про недоступність плазміну, що утворюється на фібрині, дії б2-антиплазміну.

Реакцію проводили в термостатованій кюветі спектрофотометра, в яку вносили зразки досліджуваної плазми, буферний розчин та стрептокіназу. Полімеризацію фібрину ініціювали додаванням аліквоти des ААВВ фібрин-мономеру, після чого зміну світлопропускання реєстрували при 350 нм. За часом, необхідним для зменшення максимальної величини мутності розчину на 50 %, визначали швидкість гідролізу фібрину і виражали як 1/tЅ. Вміст плазміногену визначали за калібрувальним графіком, побудованим з використанням стандартної плазми. Кількість плазміногену виражали в мкг/мл.

До переваг даного способу можна віднести: 1) використання desААВВ фібрину замість фібриногену, що дозволяє позбутися впливу фібриногену плазми та інгібіторів тромбіну на процес полімеризації фібрину; 2) визначення концентрації плазміногену безпосередньо в плазмі, що дозволяє скоротити час на отримання еуглобулінової фракції; 3) використання малої кількості плазми (10-30 мкл) та короткий час (3-10 хв), які витрачаються на одне випробування.

Loading...

 
 

Цікаве