WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну (автореферат) - Реферат

Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну (автореферат) - Реферат

Таким чином, показано, що низькомолекулярна стрептокіназа є ефективним активатором плазміногену, асоційованого з фібрином. Низька швидкість активації нею плазміногену у розчині та відсутність протекторної дії за інгібування плазміну 2-антиплазіном дозволяють пояснити вибірковість руйнування фібрину та відсутність фібриногенолізу за активації плазміногену плазми низькомолекулярною стрептокіназою.

Порівняльна характеристика активації Глу-плазміногену Е-фрагментом фібриногену, стрептокіназою та моноклональним антитілом IV-1c.До непрямих активаторів плазміногену, крім стрептокінази, належить антиплазміногенове моноклональне антитіло IV-1c, властивості і механізм дії якого досить детально вивчені (Макогоненко, 2000). При вивченні взаємодії Глу-плазміногену з Е-фрагментом фібриногену нами виявлено, що в комплексі з ним профермент змінює конформацію і з часом перетворюється на Ліз-плазміноген, що вказує на потенційні активаторні властивості Е-фрагмента.

Представляло інтерес більш детально дослідити активацію плазміногену Е-фрагментом і порівняти її з характерними особливостями механізму активації плазміногену стрептокіназою та моноклональним антитілом IV-1c, що є важливим для визначення існування в організмі неферментативної активації плазміногену та вивчення механізмів регуляції фібринолітичного процесу продуктами гідролізу фібриногену/фібрину.

Характерними ознаками неферментативної активації плазміногену є:

- утворення стійкого комплексу між проферментом та активатором;

- двоцентрова взаємодія;

- зміна конформації проферменту;

- індукція каталітичної активності;

- перетворення плазміногену на плазмін в складі комплексу;

- активація комплексом субстратного плазміногену;

- залежність активаторної активності комплексу від часу його існування.

Ймовірність домішок будь-якої протеолітичної або активаторної активності в препаратах Глу-плазміногену та Е-фрагмента виключали системою контролей з гідролізу фібрину або S 2251 та попередньою обробкою інгібіторами п-НФГБ та ДФФ.

Дослідження комплексоутворення Глу-плазміногену з Е-фрагментом показало, що за надлишку проферменту з 1 молем фрагмента можливе зв'язування 2 молей плазміногену. Взаємодія забезпечується високо- та низькоафінними ділянками зв'язування проферменту, розташованими в кринглах 1-3 та 5. Значення констант дисоціації комплексу Глу-плазміногену з Е-фрагментом співпадає з такими для Ліз-плазміногену, що свідчить про зміну конформації нативної форми проферменту.

Здатність Е-фрагмента формувати активний центр та індукувати каталітичну активність в Глу-плазміногені доведено вивільненням п-нітроаніліну з субстрату S-2251 під час його інкубації з еквімолярною сумішшю Глу-плазміногену та Е-фрагмента. За присутності ДФФ вивільнення п-нітроаніліну не спостерігається.

Електрофоретичні дослідження суміші, яку попередньо інкубували при 37 оС, виявили перетворення з часом нативної форми проферменту в частково гідролізовану, а за умов відновлення дисульфідних зв'язків в білках – утворення плазміну. З використанням методу фібринових пластин показано, що комплекс проявляє фібринолітичну активність, величина якої становить приблизно 30 % відповідної кількості плазміну. Збільшення зон лізису фібринових пластин за надлишку плазміногену свідчить про активаторну активність комплексу. Дослідження динаміки вивільнення п-нітроаніліну від часу попередньої інкубації комплексу виявило, що його активаторна активність досягає максимальної величини через 30 хв після утворення і з часом поступово зменшується, можливо, внаслідок протеолізу Е-фрагмента плазміном або автолізу останнього.

Таким чином, установлено, що Е-фрагмент спричинює в Глу-плазміногені структурні зміни, внаслідок яких в протеїназному домені проферменту формується активний центр. Проведені дослідження дозволяють віднести Е-фрагмент до активаторів плазміногену непрямої дії та

припустити фізіологічне значення неферментативної активації плазміногену в присутності Е-фрагмента. Враховуючи кількість Глу-плазміногену, що зв'язується з фрагментом, та інгібування плазміну, який утворюється в складі комплексу, б-2-антиплазміном, представляється ймовірним, що Е-фрагмент буде впливати на фібринолітичний процес за механізмом від'ємного зворотнього зв'язку, зменшуючи локальну концентрацію потенційно активного плазміногену в кров'яному згустку. Зважаючи на можливість Е-фрагмента активувати протромбін (Платонова, 2002; 2006) та перетворювати Глу-плазміноген на Ліз-форму, яка має підсилюючий вплив на полімеризацію фібрину, можна припустити, що накопичення Е-фрагмента пов'язано з ризиком повторного тромбоутворення.

Некаталітичні ділянки молекули плазміну в інгібуванні б2-антиплазміном. Роль б2-антиплазміну у фібринолітичному процесі.На завершальному етапі фібринолітичного процесу плазмін, що вивільняється в кровоток, швидко і необоротно інгібується 2-антиплазміном. Механізм реакції досить добре вивчений, але участь в ньому окремих кринглових доменів плазміну остаточно не з'ясована, що залишає відкритим питання про здатність 2-антиплазміну ефективно інгібувати низькомолекулярні похідні плазміну, які можуть утворюватись в організмі (Lijnen, 2001; Narasaki, 2005).

Проведене нами дослідження кінетики інгібування б2-антиплазміном амідолітичної активності плазміну, міні- та мікро-плазміну показало, що низькомолекулярні похідні плазміну також інгібуються б2-антиплазміном, але повільніше. Значення константи швидкості комплексоутворення з інгібітором зменшується на порядок в послідовності: плазмін, міні- та мікро-плазмін. За умов насичення лізин-зв'язувальних ділянок плазміну та міні-плазміну 6-АГК швидкість інгібування їх б2-антиплазміном зменшується до рівня мікро-плазміну (табл. 3).

З використанням міченого біотином інгібітора установлено, що він взаємодіє з фрагментами плазміногену: мікро-, міні-плазміногеном, кринглом 4 та з найвищою спорідненістю з кринглом 1-3. Величина зв'язування б2-антиплазміну з міні-плазміногеном та плазміном, який попередньо інгібували ДФФ, в присутності 6-АГК знижується до рівня мікро-плазміногену.

Крингли 1-3, 4 та міні-плазміноген за 30-разового молярного надлишку практично не впливають на інгібування плазміну еквімолярною кількістю інгібітора.

Проведені дослідження показали, що: а) швидкість реакції плазміну з б2-антиплазміном контролюється крингловими доменами; б) в протеїназному домені плазміногену/плазміну міститься відмінна від активного центра ділянка зв'язування інгібітора. Зроблено висновок, що ефективність дії б2-антиплазміну забезпечується багатоцентровою взаємодією інгібітора з ферментом.

Основною функцією б2-антиплазміну вважається нейтралізація вільного плазміну та захист білків плазми від неспецифічного протеолізу.

З метою визначення ролі інгібітора в фібринолітичному процесі були розроблені модельні системи гідролізу фібринових згустків, утворених в присутності різних компонентів фібринолітичної системи. Дослідження проводили в термостатованій кюветі спектрофотометру, реєструючи зміну оптичної густини середовища при 350 нм. Для запобігання змішування білків до початку реакції їх вносили в різні кутки кювети в мікролітрових кількостях. Полімеризацію des ААВВ фібрин-мономеру ініціювали додаванням буферу з нейтральним значенням рН. Виявлено, що фібрин швидко гідролізується за наявності в системі як плазміну, так і Глу-плазміногену та стрептокінази або тканинного активатора (рис. 11). За одночасної присутності 2-антиплазміну та плазміну фібриновий згусток не гідролізується. Інгібітор не впливає на швидкість гідролізу фібрину Глу-плазміногеном, активованим каталітичною кількістю стрептокінази, що пояснюється його низькою спорідненістю до проферменту. Плазміноген в присутності інгібітора зв'язується з фібрином і активується до плазміну. Разом з тим, в системі, що містить Глу-плазміноген і тканинний активатор, 2-антиплазмін майже повністю пригнічує гідроліз фібрину. Зважаючи на залежність активації проферменту тканинним а
ктиватором від фібрину і те, що плазмін, зв'язаний з фібрином, захищений від дії інгібітора, отриманий результат виявився несподіваним.

Подальші дослідження показали, що 2-антиплазмін практично не впливає на величину зв'язування тканинного активатора та плазміногену з фібрином, також як і амідолітичну активність активатора.

Разом з тим, в залежності від концентрації він пригнічує швидкість активації плазміногену тканинним активатором (рис. 12). Майже повне інгібування спостерігається за фізіологічної концентрації інгібітора при всіх досліджуваних концентраціях тканинного активатора.

Виявлено, що мічений біотином 2-антиплазмін зв'язується з тканинним активатором з Кd 78 нМ. Інгібітор сорбується на фібринових плівках, утворених з дезААВВ фібрину, та іммобілізованих фрагментах D та D-D і не взаємодіє з Е-фрагментом, тобто ділянки зв'язування інгібітора на фібрині розташовані в місцях локалізації активаторного комплексу. Це дозволяє зробити припущення, що інгібування 2-антиплазміном процесу активації може бути результатом стеричних перешкод для взаємодії плазміногену з тканинним активатором або зміни конформації активатора.

Loading...

 
 

Цікаве