WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну (автореферат) - Реферат

Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну (автореферат) - Реферат

Активація плазміногену нативною та низькомолекулярною (36кДа) стрептокіназою. Ефекторні властивості фібрину. Участь плазміноген/ плазмінової системи у багатьох фізіологічних та патологічних процесах в організмі обумовлює інтерес до вивчення механізмів, які забезпечують та регулюють активацію плазміногену.

Наразі відомо ферментативний та неферментативний шляхи активації плазміногену. Фізіологічні активатори – тканинний та урокіназа каталізують гідроліз пептидного зв'язку Арг561-Вал562 в плазміногені, перетворюючи його на дволанцюговий плазмін. Неферментативна активація здійснюється стрептокіназою – екзогенним білком бактеріального походження. Стрептокіназа в комплексі з плазміногеном шляхом конформаційних перебудов індукує в проферменті утворення активного центра.

Вивчення стрептокінази як активатора плазміногену викликає особливий інтерес у зв'язку з широким застосуванням ії в тромболітичній терапії, унікальними властивостями та можливістю існування в організмі подібного механізму перетворення плазміногену на плазмін.

Отримані дані щодо кристалічної структури комплексу стрептокінази з мікро-плазміном (Wang, 1998) та результати клінічних досліджень, які показали, що за тромболітичною ефективністю стрептокіназа майже не поступається рекомбінантному тканинному активатору (GUSTO, 1993), надали нового імпульсу всебічному дослідженню цього білка. Проте, роль кринглових доменів плазміногену в механізмі активації стрептокіназою залишається до кінця не з'ясованою. Відомості щодо N- і С-кінцевих ділянок активатора у взаємодії з плазміногеном та формуванні активного центра є суперечливими. Отримано рекомбінантну стрептокіназу, у якої, на відміну від нативної, відсутні 59 N-кінцевих амінокислотних залишків. Активність її, яка набагато менша за таку стрептокінази, повністю відновлюється в присутності фібрину. В плазмі вона стимулює фібриноліз за мінімального фібриногенолізу (Reed, 1999), але причини такої дії стрептокінази залишються не з'ясованими.

Тому ми вивчали роль ліганд-зв'язувальних ділянок кринглових доменів молекули плазміногену та N- і С-кінцевих ділянок стрептокінази в процесі активації, а також ефекторні властивості фібрину щодо активації плазміногену стрептокіназою.

Молекулярний механізм активації плазміногену стрептокіназою може бути представлено загальною схемою:

На першій стадії реакції стрептокіназа утворює з плазміногеном еквімолярний комплекс, на другій – викликає конформаційні перебудови в серин-протеїназному домені проферменту з формуванням активного центра і появою ферментативної активності. На наступній стадії активаторний комплекс ферментативним шляхом розщеплює в плазміногені активаційний пептидний зв'язок з утворенням плазмін-стрептокіназного комплексу або за каталітичної кількості стрептокінази – вільного плазміну.

Активацію плазміногену стрептокіназою вивчали, використовуючи специфічний хромогенний субстрат плазміну S2251. Швидкість активації визначали за швидкістю вивільнення п-нітроаніліну, поглинання якого реєстрували на спектрофотометрі при 410 нм.

Дослідження кінетики активації Глу-, Ліз-, міні- та мікро-плазміногену каталітичною кількістю стрептокінази показало, що швидкість активації залежить від наявності в молекулі проферменту кринглових доменів. Про участь розташованих в них лізин-зв'язувальних ділянок свідчить пригнічення швидкості активації Глу-, Ліз- і міні-плазміногену 6-АГК у межах концентрацій 10-5 – 10-2 М, а також нативної форми плазміногену ізольованими кринглами 1-3 та 4.

Якщо комплекс активатора з Глу-плазміногеном утворювали в присутності 6-АГК, то його амідолітична активність зменшується в залежності від концентрації 6-АГК. В той же час 6-АГК практично не впливає на амідолітичну активність попередньо сформованих комплексів.

Комплекс стрептокінази з плазміногеном або плазміном, попередньо інкубований протягом декількох годин, взаємодіє з лізин-сефарозою. Наявність стрептокінази або її фрагментів в білкових фракціях, які елююювали 6-АГК, доведено вестерн-блотом з використанням відповідних антитіл. Отже, показано, що в комплексі плазмін(оген)–стрептокіназа після формування активного центра лізин-зв'язувальні ділянки кринглових доменів вивільняються. Комплементарні їм центри в молекулі стрептокінази можуть взаємодіяти з лізин-зв'язувальними ділянками субстратної молекули плазміногену. Підтвердженням цього є зменшення на 40 та 60 % відповідно активації Глу- та Ліз-плазміногену еквімолярним комплексом плазмін-стрептокіназа в присутності 6-АГК.

Отримані результати дозволили дійти висновку, що лізин-зв'язувальні ділянки проферменту регулюють всі стадії процесу активації стрептокіназою: утворення еквімолярного комплексу з активатором, індукцію каталітичної активності плазміногену та взаємодію активаторного комплексу з субстратним плазміногеном.

Для з'ясування ролі залишків лізину на С-кінці та в складі поліпептидного ланцюга молекули стрептокінази, що можуть приймати участь у взаємодії з плазміногеном, проводили хімічну модифікацію NH2-груп стрептокінази тринітробензолсульфокислотою або обробляли її карбоксипептидазою. Відщеплення С-кінцевого лізину стрептокінази зменшує швидкість активації нею Глу-плазміногену в 3 рази, тоді як хімічна модифікація – більш ніж у 100 разів. Отримані дані свідчать про важливу роль залишків лізину і, можливо, N-кінцевого ізолейцину стрептокінази в процесі активації.

Існують різні точки зору відносно механізму формування активного центра в плазміногені у комплексі з стрептокіназою. Згідно одної з них, N-кінцевий ізолейцин стрептокінази утворює соляний місток з залишком Асп 740 плазміногену, що розташований поруч з Сер 741 каталітичної тріади (Wang,1999; Perry, 2000). Така взаємодія є пусковим механізмом формування активного центра та S1 субцентра. Згідно другої, -домен стрептокінази зв'язується з серин-протеїназним доменом плазміногену поблизу консервативного залишку Ліз 698, що викликає конформаційні зміни цієї ділянки молекули, внаслідок яких утворюється необхідний іонний зв'язок між Ліз 698 та Асп740 (Wang, Lin, 1998).

Обмежений хімотрипсиновий гідроліз стрептокінази дозволяє одержати ряд фрагментів, які зберігають спорідненість до плазміногену. З метою визначення функціональної ролі окремих ділянок молекули стрептокінази досліджували активаторні властивості фрагменту з молекулярною масою 36 кДа, у якого відсутні 7 та 4 кДа N- та С-кінцеві пептиди відповідно. Індукція каталітичної активності Глу-плазміногену за еквімолярної кількості 36 кДа стрептокінази починається лише через годину від початку інкубації за високої 200 нМ концентрації кожного з білків.Швидкість реакції уповільнюється більш ніж на два порядки порівняно з нативною стрептокіназою. Наведені результати добре узгоджуються з даними літератури про низьку активаторну активність рекомбінантної стрептокінази, у якої відсутні 59 N-кінцевих амінокислотних залишків, і свідчать про важливу роль N-кінцевої ділянки стрептокінази в процесі активації плазміногену.

Вивчення кінетики активації Глу-, Ліз- та міні-плазміногену 36 кДа стрептокіназою за 50 нМ концентрації реагуючих білків виявило, що індукція каталітичної активності Глу-плазміногену була відсутня протягом всього часу спостережень, тоді як Ліз- і міні-плазміногену починалась відповідно через 30 і 10 хв від початку реакції (рис. 10). Швидкість активації міні-плазміногену на порядок перевищує таку Ліз-плазміногену (табл. 2). Отримані результати свідчать, що N-кінцева ділянка стрептокінази відповідає за кон-формаційні зміни проферменту, які контролюють доступність центрів зв'язування стрептокінази в протеїназному домені, що є необхідними для формування активного центра. Дослідження впливу фібрину на активацію різних форм плазміногену 36 кДа фрагментом стрептокінази показало, що за присутності desAABB фібрину активація Глу-плазміногену починається після 20-30 хв лаг-періоду і відбувається з високою швидкістю (рис. 10).

Фібрин на порядок прискорює швидкість активації Ліз-плазміногену і практично не впливає на активацію міні-плазміногену низькомолекулярною стрептокіназою (табл. 2). Ці дані дозволяють дійти висновку, що певна ділянка молекули фібрину виконує функцію N-кінцевого пептиду стрептокінази, індукуючи в проферменті конформаційні зміни, які необхідні для швидкого утворення активаторного комплексу плазміногену з 36 кДа фрагментом стрептокінази.

На відміну від нативної, низькомолекулярна стрептокіназа не впливає на швидкість реакції плазміну з 2-антиплазміном – амідолітична активність ферменту повністю інгібується 2-антиплазміном в присутності еквімолярної кількості 36 кДа фрагмента стрептокінази.

Loading...

 
 

Цікаве