WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну (автореферат) - Реферат

Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну (автореферат) - Реферат

- на ранніх стадіях гідролізу фібрин(оген)у, за розщеплення С-доменів, на них утворюються або експонуються нові центри взаємодії з плазміногеном, які комплементарні ліганд-зв'язувальній ділянці четвертого крингла;

- взаємодія Глу-плазміногену з новоутвореними в молекулах фібрину центрами за участі ділянки четвертого кринглового домену обумовлює дисоціацію внутрішньомолекулярного зв'язку між третім та четверим кринглами, внаслідок чого профермент переходить у повністю відкриту просторово витягнуту конформаційну форму, що забезпечує його подальшу взаємодію за участі ділянок перших трьох кринглових доменів з комплементарними їм центрами, що існують в молекулах фібрину і локалізовані в домені Е, а можливо, і D або в зоні D-D контактів.

На основі отриманих експериментальних даних сформульовано механізм, який на ранніх стадіях гідролізу фібрину плазміном забезпечує збільшення локальної концентрації плазміногену на фібриновому згустку. Він полягає в тому, що на стадії розщеплення -ланцюгів окремих молекул фібрину з'являються нові центри зв'язування плазміногену, комплементарні низькоафінній ділянці крингла 4. Зміна конформації плазміногену, що відбувається внаслідок взаємодії з цим центром, дозволяє йому зв'язуватись високоафінною ділянкою крингла 1-3 з відповідними центрами інших молекул фібрину, що знаходяться на доступній для проферменту відстані. Плазміноген, переміщуючись на центри, комплементарні кринглу 1-3, вивільняє тим самим центр взаємодії з кринглом 4 для наступних молекул. В такий спосіб за обмеженої кількості новоутворених центрів відбувається багаторазове збільшення кількості зв'язаного з фібриновим згустком плазміногену.

Білок-білкові взаємодії в регуляції швидкості гідролізу фібрин(оген)у. Фібрин – фізіологічний субстрат плазміну одночасно є стимулятором фібринолізу. Якщо експонування центрів зв'язування плазміногену і тканинного активатора під час полімеризації фібрину забезпечує активацію проферменту та ініціює процес фібринолізу, то утворення нових центрів взаємодії з плазміногеном, що має місце на початкових стадіях цього процесу, можливо, регулює його швидкість.

Наступні дослідження були спрямовані на вирішення питання, чи впливає зміна властивостей плазміногену, що має місце за розщеплення С-кінцевих ділянок -ланцюгів молекул фібрину, на швидкість руйнування фібринового згустка.

Гідроліз нативного та частково гідролізованого desAABB фібрину Глу- або Ліз-плазміногеном, активованим тканинним активатором, досліджували з використанням турбідиметричного методу, вимірюючи зміну оптичної густини середовища при 350 нм під час утворення та розчинення полімерного фібрину. Отримані криві відображають динаміку змін в структурі згустка і дозволяють визначити ряд параметрів для кількісної характеристики фібринолітичного процесу. Швидкість гідролізу фібрину визначали за величиною t Ѕ, яка відповідає проміжку часу, що є необхідним для зменшення максимальної величини оптичної густини середовища на 50 %. Вимірювання часу від початку полімеризації до повного розчинення фібринового згустка дозволяє визначити кількість розчинних продуктів і розрахувати швидкість реакції плазмінолізу. Проміжок часу між досягненням максимальної величини оптичної густини середовища та початком її зменшення, який відповідає горизонтальному відрізку кривої, характеризує процес активації.

Показано, що швидкість руйнування полімерного фібрину залежить від концентрації кожної з форм проферменту та тканинного активатора. Проте, в усіх випадках гідроліз desААВВ фібрину відбувається вдвічі швидше за використання Ліз-плазміногену, ніж нативної форми проферменту. Порівняння кінетичних кривих гідролізу фібрину за активації Глу- та Ліз-плазміногену виявило запізнення в часі початку гідролізу при використанні Глу-плазміногену, що проявляється подовженим горизонтальним відрізком кривої. Після досягнення часу напівлізису (t Ѕ) швидкість гідролізу стає однаковою, про що свідчить тангенс кута нахилу нисхідного відрізка кривих (рис. 6). Тобто, різниця в швидкості руйнування полімерного фібрину між Глу- та Ліз-плазміногеном має місце на початкових стадіях гідролізу і залежить від швидкості активації.

Форма кривих гідролізу частково деградованого desAABB фібрину плазміном за активації Глу-плазміногену змінюється, у порівнянні з нативним фібрином, і стає подібною до таких при використанні Ліз-плазміногену, що можна пояснити зміною конформації Глу-плазміногену на Ліз-плазміноген подібну. Показано, що на частково деградованому desAABB фібрині за всіх досліджуваних концентрацій Глу-плазміногену збільшується в декілька разів як швидкість активації, так і швидкість гідролізу (рис. 7). Підвищення швидкості гідролізу спостерігається при відщепленні 1-3 % молекулярної маси фібриногену, з якого отримували препарати частково гідролізованого desAABB фібрину.

За даними залежності швидкості гідролізу нативного та частково деградованого фібрину плазміном за різних концентрацій субстрату були розраховані константи Міхаеліса, значення яких становить 7,0 та 3,3  10-7 М відповідно. Збільшення спорідненості плазміну до частково гідролізованого фібрину дозволяє припустити участь у протеолізі додаткової ділянки зв'язування ферменту.

Таким чином, установлено, що на стадії розщеплення -ланцюгів молекул фібрину має місце збільшення швидкості активації Глу-плазміногену та швидкості гідролізу полімерного фібрину. Причиною збільшення є зміна конформації плазміногену та залучення до взаємодії додаткових ділянок зв'язування ферменту. Зроблено висновок, що стадія утворення Х-фрагментів є ключовою в регуляції швидкості руйнування фібринового згустка фібринолітичною системою.

Надалі з'ясовували роль кринглових доменів в регуляції швидкості гідролізу фібриногену/фібрину плазміном. Для характеристики ранніх етапів 125І фібриноген гідролізували плазміном і вимірювали зміну в часі радіоактивності електрофоретичних зон, що відповідають сумарній фракції фібриногену та Х-фрагментів. Порівняння швидкості гідролізу плазміном, міні- та мікро-плазміном за різних концентрацій 6-АГК та аргініну дало можливість визначити участь ліганд-зв'язувальних ділянок окремих доменів ферменту на ранніх стадіях протеолізу (рис. 8, табл. 1).

Плазмін гідролізує фібриноген з найвищою швидкістю, її приймали за 100 %. У порівнянні з ним активність міні- та мікро-плазміну, у яких відсутні К 1-4 або всі кринглові домени відповідно, складає 30 та 20 %. 6-АГК в залежності від концентрації пригнічує швидкість гідролізу досліджуваної фракції плазміном та міні-плазміном до рівня мікро-плазміну і не впливає на активність останнього. В присутності 10 мМ аргініну активність плазміну знижується приблизно на 50 %. За такої концентрації аргініну, згідно з константами дисоціації для окремих кринглів, має місце насичення ділянок кринглів 1-3 та 5, тоді як ділянка крингла 4 залишається вільною. Отримані дані про те, що за блокування всіх ліганд-зв'язувальних ділянок активність плазміну знижується на 80 %, тоді як ділянок кринглів 1-3 та 5 – на 50 %, свідчать про важливе значення ділянки крингла 4 в регуляції швидкості початкових етапів гідролізу фібриногену плазміном.

Дослідження динаміки утворення та розщеплення Х-фрагментів, показало, що 10 мМ аргінін майже не впливає на швидкість розщеплення Х-фрагментів, тоді як в присутності 10 мМ 6-АГК вони накопичуються в реакційному середовищі і подальше їх руйнування потребує тривалого часу. Зроблено припущення, що найбільшого значення четвертий крингл набуває в процесі гідролізу фібриногену на стадії розщеплення Х-фрагментів.

Ефективність розчинення полімерного фібрину плазміном також значною мірою визначається крингловими доменами молекули ферменту. 6-АГК майже повністю пригнічує швидкість гідролізу фібринового згустка плазміном за концентрацій, які не впливають на активний центр, проте насичують його низькоафінні ліганд-зв'язувальні ділянки. Фрагменти плазміногену крингли 1-3 та 4, які можуть конкурувати за місця зв'язування плазміну на фібрині, ефективно впливають на процес гідролізу за спільної дії. Швидкість розчинення полімерного фібрину плазміном за 5-разового молярного надлишку кожного з фрагментів – кринглів 4 та 1-3 змінюється на 5 та 25 % відповідно, тоді як за одночасної присутності їх в інкубаційному середовищі швидкість реакції знижується більш ніж на 70 % (рис. 9).

Таким чином, доведено, що швидкість ранніх етапів гідролізу фібриногену, як і швидкість руйнування фібринового згустка плазміном контролюються крингловими доменами молекули ферменту. Отримані результати дозволяють припустити, що взаємодія некаталітичних ділянок молекули плазміну з відповідними центрами молекули субстрату орієнтує активний центр ферменту на гідроліз певних пептидних зв'язків, внаслідок чого розщеплення фібриногену/фібрину є строго спрямованим процесом.

Згідно сучасним уявленням, полімерний фібрин розщеплюється плазміном на великі надмолекулярні блоки, які складаються з фрагментів фібрил. Ефективність такого шляху визначається тим, що гідроліз відбувається лише в певних місцях фібрил у напрямку, перпендикулярному їх довжині. З погляду на отримані нами дані, можна висловити думку, що такими місцями є центри первинного зв'язування Глу-плазміногену на фібрині. На них відбувається активація проферменту, а на початкових етапах гідролізу – збільшення локальної концентрації плазміногену і швидкості його активації. Участь ділянок зв'язування різної спорідненості молекули плазміну у взаємодії з фібрином забезпечує його переміщення по DDE-трідам протофібрил, а орієнтація активного центра – гідроліз плазміном неупорядкованих ділянок в суперспіралізованій міждоменній частині молекул.

Loading...

 
 

Цікаве