WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну (автореферат) - Реферат

Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну (автореферат) - Реферат

Послідовність Аб 148-160 має незвичайне розміщення заряджених амінокислотних залишків:

148 160

Ліз-Арг-Лей-Глу- Вал-Асп-Лей-Асп-Лей-Ліз-Лей-Арг-Сер

+ + 0 – 0 – 0 – 0 + 0 + 0 ,

де від'ємні та нейтральні амінокислоти чередуються між собою і розміщені між двома наборами позитивно заряджених амінокислот. Наявність в ній ділянки, до складу якої входять Асп 155, Ліз 157 та Арг 159, дозволяє пояснити взаємодію Глу- та Ліз-плазміногену з DL-фрагментом за участі різних ліганд-зв'язувальних ділянок. Бічні радикали лізину або аргініну можуть відповідати за взаємодію з АН- (або аргініл-) зв'язувальною ділянкою крингла 5, тоді як карбоксильна група аспарагінової кислоти та аміно- або гуанідинова група лізину або аргініну можуть утворювати електростатичну пару, яка відповідає за взаємодію з лізин-зв'язувальною ділянкою кринглів 1-3.

На підставі наведених літературних даних та отриманих нами результатів про відсутність взаємодії між Глу-плазміногеном і фібриногеном, здатність нативної форми проферменту зв'язуватись з полімерним фібрином, малу і майже однакову кількість Глу-плазміногену, що сорбується на один моль фібрину та DL-фрагмента, інгібування комплексоутворення Глу-плазміногену з фібрином міні-плазміногеном та можливість останнього взаємодіяти з DL-фрагментом зроблено висновок, що первинний центр зв'язування Глу-плазміногену, який формується при переході розчинного фібриногену до полімерного фібрину, локалізовано в області D-домену.

Взаємодія Глу- та Ліз-плазміногену з частково гідролізованим фібрином. Механізм збільшення кількості Гду-плазміногену, що сорбується на фібрині, на початкових стадіях його гідролізу. За незначної кількості Глу-плазміногену, яка за фізіологічних концентрацій зв'язується з полімерним фібрином, для ефективного руйнування фібринового згустка необхідним є надходження та сорбція на фібрині додаткових молекул плазміногену. Обмежений протеоліз фібрину плазміном приводить до збільшення сорбції на ньому плазміногену. Вважається, що під час гідролізу в молекулах фібрину з'являються С-кінцеві залишки лізину, взаємодія з якими плазміногену збільшує його локальну концентрацію на фібрині. В такому разі повинна існувати кореляція між ступенем гідролізу фібрину та величиною сорбованого на ньому плазміногену. Представлені вище дані про взаємодію Глу- і Ліз-плазміногену з фрагментами фібриногену, показали, що перетворення фібриногену на Х-фрагмент не позначаеться на кількості Ліз-плазміногену, що зв'язується з цими білками, і дозволяє Глу-плазміногену, який не взаємодіє з фібриногеном, в максимальнй кількості зв'язуватись з Х- фрагментом.

Для з'ясування механізму, що спричинює на початкових стадіях гідролізу фібрину до значного збільшення кількості зв'язуваного з ним Глу-плазміногену, було проведено порівняльне дослідження взаємодії обох форм проферменту з частково гідролізованим фібрином, що утворювали з фібриногену, який попередньо обробляли плазміном. Умови обробки добирали таким чином, щоб під час гідролізу в молекулах фібриногену мало місце розщеплення лише бС доменів. Ступінь гідролізу визначали за кількістю продуктів деградації фібриногену, що залишались у розчині після утворення фібрину. Дані електрофорезу показали, що в отриманих препаратах desAABB фібрину з'являються Х-фрагменти, кількість яких збільшується з підвищенням концентрації плазміну. В усіх випадках зберігається твердо-фазна структура фібринових згустків.

Показано, що кількість сорбованого на частково гідролізованому фібрині Ліз-плазміногену є такою ж, як і на вихідному (рис. 4), і не залежить від ступеня гідролізу (рис. 5). Отже, поява С-кінцевих лізинів на початкових стадіях гідролізу фібрину не приводить до збільшення сорбції Ліз-плазміногену.

Тоді як зв'язування Глу-плазміногену з фібрином залежить від структурної цілістності складових молекул. За еквімолярного співвідношення взаємодіючих білків кількість сорбованого Глу-плазміногену на моль фібрину збільшується з 0,05 на вихідному до 0,5 молей на частково гідролізованому фібрині і досягає величини, характерної для Ліз-плазміногену (рис. 4). Для розуміння досліджуваного механізму важливе значення має виявлена експоненційна залежність кількості Глу-плазміногену, сорбованого на фібрині, від ступеня його гідролізу. Збільшення в декілька разів сорбції білка спостерігається за 0,35 % ступеня гідролізу. Максимальна кількість Глу-плазміногену зв'язується з фібрином за відщеплення 1-2 % молекулярної маси вихідного фібриногену і за умов експерименту далі не змінюється (рис. 5). Зважаючи на те, що бС-домени складають 25 % молекулярної маси фібриногену, можна стверджувати, що відсутність невеликих С-кінцевих пептидів в б-ланцюгах окремих фібрин-мономерних одиниць полімерного фібрину є достатньою умовою збільшення до максимального рівня кількості сорбованого на ньому Глу-плазміногену.

Зв'язування Глу-плазміногену з частково гідролізованим фібрином супроводжується зміною властивостей проферменту. Сорбція білка на такому фібрині, на відміну від нативного, пригнічується 6-АГК за концентрацій, що насичують високоафінні ліганд-зв'язувальні ділянки. Фрагмент плазміногену крингл 1-3 за 50-разового надлишку до Глу-плазміногену на 60 % інгібує сорбцію проферменту на частково гідролізованому фібрині, тоді як в разі нативного фібрину його вплив був відсутнім. Отже, за часткового гідролізу до взаємодії з фібрином залучаються високоафінні ділянки перших трьох кринглових доменів Глу-плазміногену, що свідчить про зміну його конформації.

Таким чином, можна зробити висновок, що на початкових етапах гідролізу фібриногену/фібрину при розщепленні А-ланцюга в молекулі з'являється новий центр взаємодії з плазміногеном, який контролює конформаційний стан проферменту. Зважаючи на появу С-кінцевих залишків лізину за гідролізу пептидних зв'язків плазміном, які найбільше відповідають лігандній специфічності ділянці крингла 4, і те, що цей крингл регулює конформаційні переходи молекули плазміногену, можна припустити, що новий центр, електростатичною складовою якого є заряджені групи С-кінцевого лізину, комплементарний ділянці, розташованій в четвертому крингловому домені плазміногену.

Висловлене припущення підтвердується наступними дослідженнями функціональних властивостей ізольованого крингла 4, які показали, що він не зв'язується з іммобілізованими Е- та D-фрагментами фібриногену, незважаючи не те, що лізин є С-кінцевим амінокислотним залишком -ланцюга в складі D-фрагмента та кожного з трьох ланцюгів обох субодиниць в складі Е-фрагмента. Крингл 4, як і Глу-плазміноген, не проявляє спорідненості до фібриноген-сефарози. Після пропускання через колонку з фібриноген-сефарозою розчину Ліз-плазміногену з слідовою спонтанною активністю або тканинного активатора крингл 4 і Глу-плазміноген набувають здатності специфічно зв'язуватись з афінним сорбентом. Поясненням цього є часткове ферментативне розщеплення іммобілізованого фібриногену плазміном, який міститься в слідовій кількості у розчині Ліз-плазміногену або утворюється за активації домішок плазміногену в препаратах фібриногену. Отже, нові центри взаємодії з плазміногеном, що з'являються на початкових стадіях гідролізу фібрин(оген)у, містяться в С-доменах і комплементарні ліганд-зв'язувальній ділянці крингла 4. Основна роль їх полягає в зміні конформації плазміногену.

В результаті проведених порівняльних досліджень взаємодії Глу- та Ліз-плазміногену з фібриногеном, його фрагментами та нативним і частково гідролізованим фібрином обґрунтовано положення про послідовність взаємодій, доменну локалізацію та етапи експонування комплементарних центрів розпізнавання молекул плазміногену/плазміну та фібриногену/фібрину в процесі полімеризації та на початкових стадіях гідролізу:

- молекула фібриногену в центральній частині – Е-домені містить експонований центр взаємодії з плазміногеном, комплементарний ліганд-зв'язувальним ділянкам перших трьох кринглових доменів молекули проферменту. Внаслідок закритої конформації Глу-плазміногену і недоступності ділянок перших трьох кринглових доменів для міжбілкових взаємодій нативна форма плазміногену та фібриноген у кров'яному руслі циркулюють незалежно один від одного;

- під час формування фібрилярної структури фібринового згустка в молекулах фібрину в області D-доменів експонуються центри взаємодії з Глу-плазміногеном, які комплементарні ліганд-зв'язувальній ділянці п'ятого крингла;

- взаємодія Глу-плазміногену з цими центрами за участі п'ятого кринглового домену обумовлює дисоціацію внутрішньомолекулярного зв'язку між п'ятим кринглом та N-кінцевим пептидом Глу-плазміногену, внаслідок чого профермент переходить у частково відкриту конформаційну форму, що забезпечує його активацію тканинним активатором до плазміну і початок гідролізу;

Loading...

 
 

Цікаве