WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну (автореферат) - Реферат

Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну (автореферат) - Реферат

На відміну від Ліз-плазміногену, Глу-плазміноген не зв'язується з фібриноген- або фібрин-мономер-сефарозою за використаних співвідношень 0,5-3,0 моля проферменту на 1 моль іммобілізованого білка. Це пояснюється закритою конформацією нативної форми проферменту та недоступністю ділянок зв'язування кринглів 1-3 для взаємодії з фібриногеном. Тому в кров'яному руслі Глу-плазміноген та фібриноген, незважаючи на їх високу концентрацію, циркулюють незалежно один від одного і утворення комплексу між ними не відбувається.

Разом з тим, Глу-плазміноген зв'язується з полімерним фібрином в кількості 0,05-0,065 молей на 1 моль фібрину, що майже на порядок нижче значень, отриманих для Ліз-плазміногену. Взаємодія Глу- і Ліз-плазміногену з фібрином характеризується різною чутливістю до 6-АГК. Кількість сорбованого Ліз-плазміногену зменшується на 50 % за концентрації 6-АГК 8  10-5 М, що насичує високоафінні ділянки зв'язування кринглів 1-3, тоді як Глу-плазміногену – в області мілімолярних концентрацій за насичення низькоафінних ділянок, розташованих в кринглах 4 або 5 проферменту (рис. 1). З'ясування участі окремих доменів Глу-плазміногену у взаємодії з фібрином показало, що за 10-50-разового молярного надлишку до проферменту ізольовані крингли 1-3 та 4 не впливають, тоді як міні-плазміноген більш ніж на 50 % знижує величину сорбції міченого біотином Глу-плазміногену на фібринових плівках (рис. 2).

Отже, в процесі полімеризації на фібрині експонуються центри взаємодії з плазміногеном, наймовірніше, комплементарні ділянці крингла 5. Вони забезпечують сорбцію нативної форми проферменту на фібрині. Оскільки крингл 5 контролює конформаційний стан Глу-плазміногену, профермент, зв'язуючись з фібрином, набуває конформації, яка забезпечує його активацію тканинним активатором і початок гідролізу.

На важливе значення крингла 5 у взаємодії нативної форми проферменту з фібрином та його активації вказують дані про те, що моноклональні антитіла до міні-плазміногену (Church, 1991) та тромбоспондин (Markus, 1996), який проявляє специфічну спорідненість до крингла 5, інгібують активацію Глу-плазміногену тканинним активатором на фібрині.

Виходячи з отриманих даних про кількість Глу-плазміногену, яка сорбується на фібрині, легко підрахувати, що на 20-30 фібрин-мономерних одиниць припадає один центр зв'язування Глу-плазміногену і тому за фізіологічної концентрації проферменту та фібриногену з фібриновим

згустком, який утворюється, зв'язується не більш ніж 1/10 кількості нативної форми плазміногену, що міститься в плазмі.

Взаємодія Глу- та Ліз-плазміногену з фрагментами фібриногену, які послідовно утворюються в процесі гідролізу плазміном. Складність процесу фібрин(оген)олізу передбачає експонування на різних його етапах нових центрів взаємодії з плазміногеном. На таку можливість вказують отримані нами дані про те, що внаслідок обмеженого протеолізу іммобілізованого на сефарозі фібриногену плазміном, за умов утворення Х-фрагмента, фібриноген набуває здатності взаємодіяти з Глу-плазміногеном, за більш глибокого гідролізу – до появи в розчині D-фрагмента, підвищується сорбційна емкість фібриноген-сефарози до Ліз-плазміногену.

Для визначення доменної локалізації плазміноген-зв'язувальних центрів молекул фібриногену/фібрину і виявлення етапів гідролізу, що приводять до експонування нових центрів, досліджували взаємодію Глу- і Ліз-плазміногену з фрагментами, що послідовно утворюються під час протеолізу фібриногену або непрошитого фібрину: Х, У, DH та Е.

Ліз-плазміноген специфічно зв'язується з переліченими фрагментами, іммобілізованими на BrCN-сефарозі, але в різній кількості і з різних афінних сорбентів елююється розчином 6-АГК або аргініну (рис. 3 А). Кількість Ліз-плазміногену, що сорбується на Х та Е-фрагментах, є однаковою і співпадає з величиною зв'язування на фібриногені. З цих сорбентів профермент повністю елююється 0,1 М 6-АГК. В найбільшій кількості профермент зв'язується з У-фрагмент-сефарозою і частково елююється 0,1 М 6-АГК, повна десорбція білка спостерігається за послідуючого використання 0,1 М аргініну. У-фрагмент складається з центрального Е- та одного з периферичних D-доменів. Ліз-плазміноген, сорбований на DH-фрагмент-сефарозі, стійкий до дії високих концентрацій 6-АГК і елююється 0,1 М аргініном. Взаємодія проферменту з DH-фрагментом має місце в присутності 0,1 М 6-АГК за умов насичення всіх ліганд-зв'язувальних ділянок кринглових доменів. В плазміногені тільки одна ділянка, що міститься в серин-протеїназному домені, проявляє вузьку специфічність до бічних радикалів аргініну в білках та лігандів з позитивно зарядженою гуанідиновою групою. Очевидно, саме вона відповідає за взаємодію Ліз-плазміногену з DH-фрагментом.

За подальшого протеолізу DH-фрагмента за певних умов плазміном або іншими гідролітичними ферментами відщеплюються С-кінцеві ділянки -ланцюга або -ланцюга і утворюються DL- та DLa-фрагменти відповідно, що супроводжується конформаційними змінами у просторовій орієнтації доменів, з яких складено D-фрагмент (Медведь, 1989).

Наші дослідження взаємодії Ліз-плазміногену з DL- та DLa-фрагментами виявили, що профермент зв'язується з кожним з цих сорбентів і, на відміну від DH-фрагменту, повністю елююється 6-АГК. Очевидно, в результаті структурних перебудов, які мають місце при переході DH-фрагмента до низькомолекулярних фрагментів, експонуються або з'являються центри взаємодії з плазміногеном відповідні одній з лізин-зв'язувальних ділянок. На можливість локалізації центра в суперспіралізованій області DH-фрагмента вказують існуючі дані про те, що Ліз-плазміноген та крингл 1-3 зв'язуються з високою спорідненістю з ізольованим фрагментом, що відповідає цій області (Lezhen, 1986).

Отримані результати про взаємодію Ліз-плазміногену з фібриногеном та його фрагментами свідчать, що в фібриногені центри зв'язування плазміногену локалізовано в центральному Е та периферічних D доменах. Розташовані в D доменах центри є скритими, вони експонуються під час гідролізу фібриногену – при утворенні У-фрагмента та низькомолекулярних D-фрагментів.

Дані дослідженнь комплексоутворення Глу-плазміногену з іммобілізованими фрагментами фібриногену представлені на рис. 3 Б. Як зазначалось вище, внаслідок закритої конформації нативна форма плазміногену не взаємодіє з фібриногеном. Разом з тим, Глу-плазміноген специфічно зв'язується з ранніми та пізніми продуктами гідролізу фібриногену – Х- та Е-фрагментами в однаковій кількості, величина якої близька до кількості сорбованого на цих фрагментах Ліз-плазміногену. Дані концентраційної залежності сорбованого Глу-плазміногену від нанесеного на колонку з Е-фрагмент-сефарозою, представлені в координатах Скетчарда, показали, що подібно до Ліз-плазміногену, взаємодія відбувається за участі двох типів центрів Глу-плазміногену – з високою та низькою спорідненістю до Е-фрагменту, з Кd відповідно 1,8∙10-6 та 7,5∙10-5 М. Близькі значеннями Кd свідчать, що комплексоутворення обох форм проферменту з Е-фрагментом відбувається за участі однакових ділянок зв'язування. Отримані дані показали, що при взаємодії Глу-плазміногену з фрагментами, які утворюються в процесі гідролізу фібриногену, його конформація може змінюватись на Ліз-плазміноген подібну.

Глу-плазміноген, на відміну від Ліз-плазміногену, не взаємодіє з DH-фрагментом і зв'язується з DL-фрагментом в невеликій кількості – 0,04-0,05 молей на моль фрагмента з низькою спорідненістю, Кd дорівнює 20 мкМ. Відсутність взаємодії Глу-плазміногену з DH-фрагментом можна пояснити тим, що в молекулі Глу-плазміногену, структура якого має форму кільця спіралі, N-кінцева ділянка поліпептидного ланцюга, що містить перші три кринглові домени, перекриває частину поверхні серин-протеїназного домену, в якій, очевидно, розташована ліганд-зв'язувальна ділянка, що забезпечує взаємодію Ліз-плазміногену.

Кількісні параметри взаємодії Глу-плазміногену з DL-фрагментом відрізняються від таких Ліз-плазміногену і подібні до значень, що характеризують взаємодію Глу-плазміногену з фібрином. Для того щоб з'ясувати, яка з низькоафінних ділянок плазміногену здатна взаємодіяти з DL-фрагментом, досліджували зв'язування з ним крингла 4 та міні-плазміногену. Крингл 4 не взаємодіє, тоді як міні-плазміноген специфічно зв'язується з DL-фрагментом, сорбований білок не чутливий до дії низьких концентрацій 6-АГК, але може бути елюйований з колонки розчином 0,1 М 6-АГК або 0,1 М аргініну. Отримані дані показують, що взаємодія Глу-плазміногену з DL-фрагментом, як і з фібрином, може відбуватись за участі ліганд-зв'язувальної ділянки п'ятого крингла.

Дослідження процесу активації плазміногену тканинним активатором на фібрині та фрагментах бромціанового розщеплення фібриногену дозволили установити, що послідовність 148-160 А-ланцюга, яка входить до суперспіральної частини D-фрагмента, відповідає за взаємодію з плазміногеном (Nieuwenhuizen, 2001). З використанням моноклональних антитіл доведено, що ця послідовність є закритою в молекулі фібриногену та DH-фрагменті, але експонована на фібрині (Schielen, 1991). Її експонування відбувається під час полімеризації фібрину на стадії латеральної асоціації протофібрил (Yang, 2000) або за фрагментації DH-фрагмента (Yakovlev, 2000).

Loading...

 
 

Цікаве