WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну (автореферат) - Реферат

Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну (автореферат) - Реферат

Матеріали та методи досліджень. Glu-плазміноген та Ліз-плазміноген виділяли відповідно з плазми крові донорів і фракції ІІІ2,3 по Кону шляхом афінної хроматографії на лізин-сефарозі 4В (Deutch, Mertz, 1970).

Фрагменти плазміногену – крингл 1-3, крингл 4 і міні-плазміноген одержували з еластазного (Sottrup-Jensen et al., 1978), тоді як мікро-плазміноген – з плазмінового (Shi, Wu, 1988) гідролізатів Ліз-плазміногену.

Плазмін, міні- та мікро-плазмін одержували за активації Глу-плазміногену, міні- та мікро-плазміногену урокіназою, що була іммобілізована на сефарозі 4В (Norman et al., 1985).

Фібриноген виділяли з оксалатної плазми крові бика шляхом фракційного висолювання сульфатом натрію (Варецька та ін., 1961).

ДезААВВ фібрин одержували, обробляючи фібриноген тромбіном (Pozdnjakova et al., 1979) та розчиняючи утворені фібринові згустки в 0,02 М оцтовій кислоті. Для інактивації фактора XIIIа та видалення плазміногену процедуру проводили за присутності пара-хлормеркурійбензоату натрію (п-ХМБ) та 6-аміногексанової кислоти (6-АГК).

Фрагменти фібриногену, DH- та Е-фрагменти отримували з плазмінового гідролізату фібриногену на КМ-сефадексі G-50 (Белицер, 1972). DL-фрагмент – пепсиновим гідролізом DH-фрагмента (Medved, 1988 ). DLа-фрагмент – плазміновим гідролізом фібриногену в присутності фізіологічної концентрації іонів кальцію (Medved, 1986). D-D – з плазмінового гідролізату стабілізованого фактором ХІІІа фібрину шляхом гель-фільтрації на сефакрилі S-300 з послідуючою доочисткою на КМ-сефадексі G-50 (Белицер и др. 1986).

б2-Антиплазмін одержували з виснаженої на плазміноген та гістидин-збагачений білок плазми крові донорів на кринглі 1-3 (форма ІІ)-сефарозі.

Стрептокіназу (Kabikinase, Швеція) очищали від альбуміну на цибакрон-сефарозі CL-6B (Castellino et al., 1976).

Фрагмент стрептокінази з молекулярною масою 36 кДа виділяли препаративним електрофорезом з б-хімотрипсинового гідролізату стрептокінази (Корольчук, 2000).

Моноклональне антитіло IV-1c до Глу-плазміногену людини виділяли з супернатантів гібридомних клітин, одержаних у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, на плазміноген-сефарозі.

Антистрептокіназні антитіла одержували із сироватки крові людей, які пройшли курс лікування стрептокіназою, на протеїн-А сефарозі з подальшою доочисткою на стрептокіназ-сефарозі.

Протеолітичну активність плазміну і потенційну – плазміногену визначали казеїнолітичним методом (Robbins, Summaria, 1979) та за кількістю аміногруп, що вивільняються протягом гідролізу казеїну (Кастрикіна та ін., 1981).

Амідазну активність плазміну визначали з використанням хромогенного субстрату S2251 (H-D-Val-L-Leu-L-Lys-p-нітроаніліну гідрохлорид) за методом виробника (Kabi Diagnostica).

Фібриногенолітичну активність плазміну визначали за кількістю продуктів гідролізу фібриногену, що втрачали здатність утворювати фібриновий згусток.

Гідроліз фібрину визначали турбідиметричним методом (Bouvier, 1975) та методом фібринових пластин (Haverkate, 1975).

Швидкість гідролізу 125І-фібриногену визначали за кількістю утворених фрагментів, вимірюючи радіактивінсть відповідних їм електрофоретичних зон.

Інгібіторну активність б-2-антиплазміну визначали за здатністю гальмувати амідолітичну активність плазміну.

Кінетику інгібування плазміну та його похідних б2-антиплазміном, активацію Glu-плазміногену тканинним активатором та стрептокіназою вивчали з використанням специфічного хромогенного субстрату плазміну S2251.

Взаємодію білків досліджували декількома способами: зв'язування Глу- та Ліз-плазміногену з фібриногеном та його фрагментами, іммобілізованими на сефарозі 4В, – методом рівноважної афінної сорбції; плазміногену з фібрином, – визначаючи кількість білка, що специфічно зв'язується з фібриновим згустком під час його утворення; мічених біотином б2-антиплазміну з плазміном, тканинним активатором плазміногену, фрагментами плазміногену та фібриногену/фібрину, а також стрептокінази з плазміном і фрагментами плазміногену та плазміногену з фібриновими плівками, утвореними з desAABB мономерного фібрину, – з використанням принципу імуноферментного аналізу та авідин-біотинової реакції.

Вестерн-блот аналіз плазмін-стрептокіназного комплексу здійснювали згідно із стандартним протоколом (Burnett, 1981).

Фермент-зв'язаний імуносорбційний аналіз (ELISA) використовували для визначення титру антистрептокіназних антитіл в сироватці крові людини та спорідненості одержаних антитіл до стрептокінази.

Мічення білків 125І та біотином відповідно здійснювали із застосуванням хлораміну-Т (McConahey, 1980) та сукцинімідобіотину (Gilting et al., 1987).

Іммобілізацію білків проводили на сефарозі 4В після її активації бромціаном (March, 1974).

Хімічну модифікацію гуанідинових та аміногруп груп залишків аргініну та лізину в білках проводили за допомогою циклогександіону (Trexler, 1982) та малеїнового ангідриду (Butler, 1969) відповідно.

Електрофорез у поліакриламідному гелі проводили за присутності ДС-Na для перевірки гомогенності отриманих білків (Laemli, 1970) та в системі сечовина/оцтова кислота за низьких значень рН – для визначення форми одержаного плазміногену (Panyim, Chalkley, 1969).

Математичну обробку результатів досліджень виконували за допомогою пакету ORIGIN 6.1. До роботи включено результати експериментів, допустима похибка яких не перевищувала 6 відсотків (р < 0,06). Криві, що представлені на рисунках, є типовими для серії повторних дослідів (щонайменше три в кожній серії).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Комплексоутворення Глу- і Ліз-форм плазміногену з фібриногеном/

фібрином. Нативною формою плазміногену, який циркулює у крові, є Глу-плазміноген, що містить глутамінову кислоту на N-кінці. Молекула складається з N-кінцевого пептиду, п'яти кринглових доменів та серин-протеїназного домену, в якому в процесі активації до плазміну формується активний центр. В кринглових доменах розташовані ліганд-зв'язувальні ділянки. Тонкі структурні відмінності, що існують між ними, обумовлюють різну спорідненість і специфічність окремих ділянок до низькомолекулярних лігандів – лізину та аргініну і їх аналогів, а також високоспецифічне розпізнавання різних макромолекул. Внутрішньомолекулярні взаємодії N-кінцевого пептиду з п'ятим кринглом та третього крингла з четвертим забезпечують закриту конформацію Глу-плазміногену у розчині.

Під час досліджень використано: нативний Глу- або частково гідролізований Ліз-плазміноген, у якого відсутній N-кінцевий пептид, як форми проферменту, що різняться за конформацією та здатністю до міжбілкових взаємодій; окремі фрагменти плазміногену з різним набором кринглових доменів – крингли 1-3, крингл 4, міні-плазміноген, що складається з серин-протеїназного домену та крингла 5, і мікро плазміноген, у якого відсутні всі кринглові домени; низькомолекулярні ліганди – аналог лізину 6-аміногексанову кислоту (6-АГК) та аргінін для блокування певних ділянок зв'язування. З використанням одержаних високоочищених білків: різних форм плазміногену, плазміну, фібриногену, фібрин-мономеру, тромбіну, тканинного активатора плазміногену, стрептокінази, 2-антиплазміну, ізольованих фрагментів цих білків розроблено системи, що моделюють певні стадії процесу фібринолізу за фізіологічних умов.

Взаємодія плазміногену з фібрином, по перше, є необхідною умовою активації проферменту і послідуючого лізису фібринового згустка, по-друге, визначає вибірковість руйнування фібрину плазміном in vivo. Зважаючи на суперечливість даних щодо взаємодії різних форм плазміногену з фібрин(оген)ом і кількості сорбованого білка та обмежені відомості про участь в цьому процесі окремих ліганд-зв'язувальних ділянок проферменту та локалізацію комплементарних центрів взаємодії з плазміногеном в молекулах фібриногену/фібрину, проведено детальне дослідження комплексоутворення Глу- і Ліз-форм плазміногену з фібриногеном, фібрин-мономером, полімерним фібрином, фрагментами фібриногену, що утворюються в процесі гідролізу, а також вплив обмеженого протеолізу фібрин(оген)у плазміном на зміну конформації та властивості обох форм проферменту.

Взаємодія Глу- та Ліз-плазміногену з фібриноген-сефарозою, фібрин-мономер-сефарозою та полімерним фібрином. Показано, що за еквімолярного співвідношення взаємодіючих білків Ліз-плазміноген специфічно сорбується на фібриноген-сефарозі, фібрин-мономер-сефарозі та полімерному фібрині в однаковій кількості – 0,5 молей на 1 моль білка. В усіх випадках специфічно сорбований білок елююється 0,1 М 6-АГК. Кd комплексу Ліз-плазміногену з фібриноген-сефарозою дорівнює 5,6 мкМ, один центр зв'язування плазміногену припадає на одну молекулу фібриногену. З усіх фрагментів плазміногену ізольований крингл 1-3 зв'язується з фібриноген-сефарозою, а розчинний фібриноген – з іммобілізованим кринглом 1-3. Отримані дані свідчать, що молекула фібриногену містить центр взаємодії з плазміногеном, комплементарний ділянкам зв'язування кринглів 1-3. Очевидно, цей центр зберігається при відщепленні фібринопептидів А і В та експонований в фібрин-мономерних одиницях полімерного фібрину.

Loading...

 
 

Цікаве