WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Створення та експериментальне дослідження активності ліпосомної форми препарату тимічних гормонів (автореферат) - Реферат

Створення та експериментальне дослідження активності ліпосомної форми препарату тимічних гормонів (автореферат) - Реферат

Вплив тимосоміну на продукцію фактору некрозу пухлин (ФНП) визначали за цитотоксичною дією супернатантів клітинних культур на чутливі до ФНП клітини L929 Дзюблик І.В. та ін., 2001. Визначали вплив тимосоміну на спонтанну та індуковану ліпополісахаридом (ЛПС) продукцію цього цитокіну.

Для статистичного аналізу використовували критерій Ст'юдента (t) і непараметричний критерій Вілкоксона-Манна-Уітні (U) та критерій знаків (z) Лакин Г.Ф., 1990.

Результати досліджень та їх обговорення. Для фракціонування екстракту тимусу звичайно і найчастіше використовується певний набір стандартних методичних підходів в різних комбінаціях. Завдяки тому, що активні фактори знаходяться в досить широкому діапазоні молекулярної маси, комбінацію процедур фракціонування можна підібрати таким чином, щоб умови отримання активних фракцій підходили і для подальшого їх одержання в ліпосомній формі.

Маючи за мету розробку методики отримання активного препарату гормонів тимусу, ми використали фракціонування водно-сольового екстракту тимусу телят сірчанокислим амонієм, органічними розчинниками (ацетоном та етанолом), діаліз та нагрівання для дослідження технологічних схем отримання препаратів гормонів тимусу. Дослідження фракцій, отриманих при фракціонуванні водно-сольового екстракту тимусу ацетоном показало, що таке осадження біологічно-активних речовин тимусу, навіть практично без будь-яких додаткових процедур, забезпечує досить ефективне очищення від значної кількості баластних речовин. Для одержання активного препарату тимічних гормонів збирали матеріал, який осаджувався в діапазоні обємного вмісту ацетону між 55% та 85%, так як саме в цих фракціях спостерігалась досить висока активність в тесті відновлення Thy1-антигену на спленоцитах тимектомованих мишей - 3 мкг/мл. Найбільша кількість поліпептидів в такому препараті визначалась, головним чином, в діапазоні ММ нижче 30 кД, тобто мала молекулярну масу, притаманну поліпептидам родини тимозинів.

Для вивчення здатності отриманого препарату індукувати синтез РТПА нормальним і тимектомованим мишам СВА вводили 1 мкг препарату внутрішньомязово і через 4 або 24 години в пулах сироватки крові вимірювали титр РТПА. Log2 титру РТПА у нормальних мишей СВА становив 6,0. Через 4 години після введення тимоіндуктину він складав 6,2, а через 24 години – 5,8. У тимектомованих мишей вихідна кількість РТПА складала 0,2 (log2 титру). Під впливом тимоіндуктину log2 титру збільшувався до 5,6 через 4 години та дорівнював 2,5 через 24 години після введення. Враховуючи, що фракція 55-85 виявила здібність до індукції РТПА in vivo в менших дозах, ніж кількість препарату, що проявляє вплив in vitro в тесті Bach, а також те, що індукція РТПА є одним із головних механізмів дії гормонів тимусу in vivo, наявність такої активності підкреслили в назві препарату - тимоіндуктин. Спосіб отримання препарату запатентовано Нікольський та ін., 2003.

Далі здавалось необхідним отримати не лише активний розчинний і в багатьох відношеннях традиційний препарат за простою економічною схемою, але й доповнити притаманні препаратам гормонів тимусу властивості новими механізмами впливу. Враховуючи, що при отриманні тимоіндуктину найбільший вихід біологічно активних субстанцій тимусу спостерігається при фракціонуванні ацетоном в діапазоні 55-85% його концентрації, при цьому високоактивна і найменш гетерогенна фракція отримується в діапазоні концентрації ацетону 70-85%, а також маючи на увазі здатність ацетону розчиняти полярні ліпіди, зокрема фосфоліпіди, котрі є основним будівельним матеріалом при утворенні ліпідного бішару ліпосом, було розроблено методику отримання ліпосомного препарату гормонів тимусу методом обернення фаз. Препарат отримав назву тимосомін (рис. 1). Спосіб отримання препарату запатентовано Нікольський та ін., 2003.

Активність тимосоміну в тесті відновлення експресії Thy1-антигену на спленоцитах тимектомованих мишей виявлялась при концентрації білку 1,3 мкг/мл. Середній діаметр ліпосом та їх концентрація в тимосоміні становили відповідно 0,55 мкм та 1,5х108 ліпосом/мл, а вміст білка складав близько 1 мг/мл. Білкова частина ліпосомного препарату представлена набором поліпептидів, які, за даними електрофорезу в поліакриламідному гелі, переважно містяться в зоні активної фракції отриманого нами імунокорегуючого препарату тимоіндуктину. Ліпідна складова тимосоміну, проаналізована методом тонкошарової хроматографії, містить холестерин, фосфатидилетаноламін, фосфатидилхолін, сфінгомієлін і лізофосфатидилхолін.

Етап1

Звільнення тканини тимусу від жиру, плівок, кров'яних судин. Подрібнення

Етап 2

Гомогенізація тканини тимусу в 70% ацетоні

Етап 3

Отримання екстракту тканини тимусу

Етап 4

Випаровування надосадової рідини

Етап 5

Діаліз екстракту проти фізіологічного розчину

Рис.1 – Схема отримання тимосоміну

Індукторну активність тимосоміну вивчали на мишах лінії СВА по здатності препарату індукувати in vivo синтез РТПА. Нормальним або тимектомованим мишам вводили внутрішньом'язово 1 мкг тимосоміну (по білку, визначеному за методом Лоурі) і через 4 та 24 години в пулах сироватки крові мишей вивчали рівень РТПА.

Log2 титру РТПА в сироватці крові нормальних мишей СВА становив 6,0. через 4 години після введення тимосоміну він збільшувався до 7,8, а через 24 години – до 7,2. У тимектомованих мишей вихідна кількість РТПА складала 0,2 (log2 титру). Під впливом тимосоміну log2 титру збільшувався до 10,0 через 4 години та до 5,6 через 24 години після введення. З отриманих даних можна зробити висновок про високу індукторну активність тимосоміну.

Для визначення особливостей впливу тимосоміну на функціональну активність клітин, що приймають участь в імунних реакціях, дослідження проводили in vitro з клітинами імунної системи донорів крові та двох груп імуноскомпроментованих людей: ВІЛ-інфікованих та постраждалих від аварії на ЧАЕС. Досліджувані групи людей з імунодефіцитами принципово відрізняються за механізмами, що формують порушення імунної системи, за виключенням обєднуючої для обох груп характеристики, а саме недостатності ендокринної функції тимусу Головизин М.В., 1996; Ярилин А.А., 1997; Чумак А.А., Холодная Л.С., 2001; Запорожан В.М., Аряєв М.Л., 2004. Відповідно, клітини імунної системи таких людей, що досліджуються у порівнянні, є важливою, адекватною та інформативною моделлю для визначення можливостей нового препарату гормонів тимусу.

Концентрацію тимосоміну, що застосовувалась в тестах in vitro, визначали за відсутністю токсичного впливу на еритроцити барана. Такою є концентрація 6 мкг/мл. Для визначення впливу менших кількостей препарату також вивчався тимосомін в концентрації 0,6 мкг/мл. Для більш чіткого формування уявлення про особливості механізму дії тимосоміну досліджували ліпосомний препарат ліпін в концентрації 0,175 мг/мл (за перерахунком з рекомендованої дози) та розчинний препарат гормонів тимусу тималін в концентрації 6 мкг/мл (в відповідності до концентрації тимосоміну).

При вивченні адгезивної активності лімфоцитів визначили, що така в групі ВІЛ-інфікованих людей достовірно знижена (р<0,05) в порівнянні з показниками групи донорів крові. Визначене нами зниження показників аЕ-РУК в групі ВІЛ-інфікованих говорить про виражену функціональну недостатність Т-лімфоцитів і, ймовірно, свідчить про поглиблення імунних розладів у обстежених людей.

Відносна кількість аЕ-РУК у постраждалих від аварії на ЧАЕС не відрізнялась від такої у донорів крові (табл. 1).

Таблиця 1

Кількість аЕ-РУК після інкубації лімфоцитів з препаратами in vitro (%)

Групи

Фізіологіч-ний розчин

Тималін

Ліпін

0,175 мг/мл

Тимосомін

200 мкг/мл

6 мкг/мл

6 мкг/мл

0,6 мкг/мл

Донори крові

61,62,3

63,52,2

59,92,9

56,73,0

66,12,0*

60,23,8

n

18

18

18

11

18

16

ВІЛ-інфіковані

54,22,2#

57,12,0

55,72,5

51,23,8

59,72,4*

58,62,8

n

24

24

24

16

24

20

Постраждалі від аварії на ЧАЕС

61,62,2

56,92,6

60,63,3

59,11,7

59,62,2

62,52,8

n

20

20

20

20

20

20

Loading...

 
 

Цікаве