WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Створення та експериментальне дослідження активності ліпосомної форми препарату тимічних гормонів (автореферат) - Реферат

Створення та експериментальне дослідження активності ліпосомної форми препарату тимічних гормонів (автореферат) - Реферат

Методи дослідження: імунологічні, фізико-хімічні, біохімічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше отримано препарат тимічних гормонів в ліпосомній формі – тимосомін. Застосований метод обернення фаз, який включає одержання розчину гормонів та ліпідів тимусу в 70% ацетоні з наступним його випаровуванням. При дослідженні умов створення ліпосомного препарату гормонів тимусу вперше встановлено, що ефективне фракціонування водно-сольового екстракту тимусу з метою отримання препарату, активного в тесті відновлення експресії Thy1-антигену на спленоцитах тимектомованих мишей, може бути досягнуто за допомогою ацетону практично без застосування допоміжних процедур. Найбільш активна фракція осаджується при 70-85% концентрації ацетону. На способи отримання розчинного та ліпосомного препаратів гормонів тимусу отримано патенти.

Тимосомін відновлює експресію Thy1-антигену на спленоцитах тимектомованих мишей та індукує синтез речовин з тимозиноподібною активністю in vivo. В дослідах in vitro встановлено, що тимосомін є імуномодулятором і проявляє виражену активність in vitro на об'єктах різного походження: лімфоцити і нейтрофіли донорів крові, постраждалих від аварії на ЧАЕС та ВІЛ-інфікованих людей, в різних імунологічних реакціях: адгезивній та проліферативній активності лімфоцитів, природній цитотоксичності, поглинальній і бактерицидній активності нейтрофілів та продукції ФНП. Вперше показано, що в досліджуваних системах вплив тимосоміну відрізняється від такого і розчинних тимічних препаратів, і від ліпіну, що може свідчити про особливості механізму його дії.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблені і запатентовані нові способи одержання розчинного та ліпосомного препаратів гормонів тимусу. Висока імунобіологічна активність препаратів, важливі відмінності в механізмі дії ліпосомного препарату і простота технологічних схем його одержання разом з наявною потребою в ефективних тимічних імуномодуляторах робить перспективними ці технології з точки зору впровадження у фармацевтичну промисловість з наступним клінічним використанням. Результати експериментальних досліджень механізму дії нового препарату виявили деякі найбільш суттєві точки його впливу на клітини імунної системи, що в подальшому може бути покладено в основу розробки показань для клінічного застосування препаратів тимічних гормонів в ліпосомній формі.

Особистий внесок здобувача. Планування роботи, її теоретичне обгрунтування та розробка методичних підходів щодо проведення досліджень здійснені разом з науковим керівником. Автор самостійно проаналізувала відповідну літературу, виконала експериментальні дослідження, статистично обробила й проаналізувала отримані результати, зробила висновки. Біохімічні дослідження (електрофорез та тонкошарову хроматографію) здійснено спільно з к.б.н. Васильєвим В.М. (Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, Київ).

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації оприлюднені на науково-практичній конференції "Профілактика і лікування основних захворювань постраждалого населення через 16 років після Чорнобильської катастрофи" (Київ, 2002), VI звітно-виборній та науковій конференції Українського товариства фахівців з імунології, алергології та імунореабілітації (Київ, 2002), науково-практичній конференції "Експериментальна радіобіологія. Гігієна харчування. Дієтологія" (Київ, 2003), Четвертій міжнародній науково-практичній конференції "Актуальні проблеми навчання та виховання людей з особливими потребами" (Київ, 2003), І Всеукраїнській науково-практичній конференції "Імунотропні препарати в клінічній практиці" (Київ, 2004), VII Всеукраїнській науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації (Київ, 2005), Науково-практичній конференції молодих вчених "Досягнення молодих вчених – майбутнє медицини" (Харків, 2005), Міжнародній конференції "Двадцять років Чорнобильської катастрофи. Погляд у майбутнє" (Київ, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи надруковано 15 робіт, із них 4 статті в фахових виданнях, 8 тез доповідей в матеріалах науково-практичних конференцій, 1 інформаційний лист, отримано 2 патенти.

Обсяг та структура дисертації. Робота складається із вступу, огляду літератури, викладу основних методик дослідження, двох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел. Роботу викладено на 172 сторінках друкованого тексту, ілюстровано 51 таблицею та 21 рисунком. Перелік використаних джерел містить 361 найменування, серед яких 125 вітчизняних та 236 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи досліджень. Для отримання препаратів використовували тимус телят. При фракціонуванні екстрактів тимусу застосовували такі маніпуляції як висолювання сульфатом амонію, осадження органічними розчинниками, нагрівання та діаліз. Концентрацію білку визначали методом Лоурі Шелифіст А.Є. та ін., 2003. Поліпептидну частину отриманих фракцій характеризували за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі, що містив додецилсульфат натрію Гааль Э. и др., 1982. Ліпідний склад ліпосомного препарату тимосоміну вивчали за допомогою тонкошарової хроматографії Шаршунова М. и др., 1980. Визначення діаметру та концентрації ліпосом проводили методом спектру мутності Безрукова А.Г., Розенберг О.А., 1981; Кленин В.И. и др., 1977. Активність фракцій визначали за чутливістю спонтанних розеткоутворюючих клітин (сРУК) селезінки тимектомованих мишей СВА до анти-Thy1-сироватки Bach J.F. et al, 1973. Визначення здатності отриманих препаратів індукувати синтез речовин з тимозинподібною активністю (РТПА) у нормальних та тимектомованих мишей проводили в експерименті на 30 мишах лінії СВА Bach J.F. et al, 1973.

Імунобіологічну активність тимосоміну визначали in vitro зі зразками крові 24 донорів крові, 21 постраждалого від аварії на ЧАЕС та 25 ВІЛ-інфікованих людей.

Група людей, постраждалих від аварії на ЧАЕС, складалась із осіб 20-34 років, які були відселені з м. Прип'ять в 1986 році. Компонента дози отриманого зовнішнього опромінення, обумовлена перебуванням на території 30-кілометрової зони до моменту евакуації, складала 3-6,4 Бер.

Група хворих на ВІЛ-інфекцію в стадії СНІД-асоційованого комплексу складалася із осіб 20-30-річного віку.

Для формування уявлення про особливості дії тимосоміну його активність порівнювали із такою ліпосомного препарату ліпіну ("Біолік") в концентрації 0,175 мг/мл (за перерахунком з рекомендованої дози) та розчинного препарату гормонів тимусу тималіну ("Біофарма") в концентрації, яка за вмістом білку, визначеного методом Лоурі, відповідала концентрації тимосоміну.

Вплив тимосоміну на адгезивну активність лімфоцитів вивчали в тесті розеткоутворення за дещо модифікованою нами методикою Никольский И.С. и др., 1998. Визначали такі клітини: Т-лімфоцити, які активно утворюють розетки з еритроцитами барана (аЕ-РУК) та субпопуляцію незрілих В-лімфоцитів, які реагують з еритроцитами миші (Ем-РУК). В цих тестах додатково використовували тималін в концентрації 200 мкг/мл (концентрація, яку рутинно використовують для визначення дії гормонів тимусу на Е-РУК). Така концентрація забезпечує прямий вплив на лімфоцити.

Вплив тимосоміну на спонтанну та індуковану ФГА (20 мкг/мл) проліферативну активність лімфоцитів визначали по інтенсивності бластоутворення in vitro Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С., 1978.

Вплив тимосоміну на природну цитотоксичність лімфоцитів визначали морфологічним методом Шпакова и др., 2000. В якості клітин-мішеней для природних кілерів використовували клітини еритробластоїдної лінії К-562.

Дію тимосоміну на функціональну активність нейтрофілів вивчали шляхом визначення їх поглинальної та бактерицидної активності. Поглинальну активність нейтрофілів визначали як відносну кількість нейтрофілів, здатних поглинати клітини St.aureus. Кисневозалежну бактерицидну активність нейтрофілів оцінювали методом відновлення нітросинього тетразолію (НСТ) за кількістю (у відсотках) поліморфноядерних клітин, що містять темно-сині гранули діформазану. Визначали три види бактерицидності - спонтанну, індуковану та резервну. Індукована бактерицидність - це значення бактерицидності зразків клітин, що інкубували з інактивованим стафілококом. Резервна бактерицидність - це різниця значень індукованої та спонтанної бактерицидності Дуглас С.Д., Куй П.Г., 1983.

Loading...

 
 

Цікаве