WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Кріоконсервування фрагментів органів ссавців і біологічна дія одержаних з них водно-сольових екстрактів (автореферат) - Реферат

Кріоконсервування фрагментів органів ссавців і біологічна дія одержаних з них водно-сольових екстрактів (автореферат) - Реферат

Публікації. Основні положення дисертації викладені в 61 науковій праці: 32 статтях, опублікованих в фахових наукових виданнях, 4 патентах, 2 методичних рекомендаціях і 23 тезах доповідей.

Структура дисертації. Робота викладена на 272 сторінках. Вона має вступ, основну частину, яка складається з трьох розділів (огляд літератури, матеріали і методи дослідження, отримані результати та їх обговорення), аналіз і узагальнення результатів, висновки. Список використаної літератури складає 487 джерел і викладений на 55 сторінках. Дисертація містить 31 рисунок та 52 таблиці.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Експерименти проведені відповідно до "Загальних принципів експериментів на тваринах", схвалених II Національним конгресом з біоетики (20.09.04 р., Київ, Україна) і узгоджених з положеннями "Європейської Конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних і інших наукових цілей" (Страсбург, 1985).

В дослідженнях були використані фрагменти органів статевозрілих свиней та новонароджених поросят, а також водно-сольові екстракти, які одержували з кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів. Фрагменти печінки одержували шляхом продавлювання її шматочків через решітку з отворами діаметром 0,8 мм, а фрагменти підшлункової залози та селезінки - подрібнюючи шматочки органів ножицями. Маса фрагментів становила в середньому 2 – 5 мг.

Перед кріоконсервуванням до фрагментів органів по краплях додавали в співвідношенні 1:1 розчин кріопротектора подвійної концентрації, завись ретельно і обережно перемішували та розфасовували в поліетиленові ампули об'ємом 1,5 або 20 мл при заморожуванні зі швидкостями охолодження 1, 10 та 100єС/хв. При заморожуванні зі швидкостями охолодження 1000, 8000 та 80000єС/хв матеріал поміщали в контейнери з алюмінієвої фольги товщиною 30 мкм. Товщина заморожуваного шару становила 0,3 мм. Розмір контейнера 40х45 мм.

Заморожування фрагментів проводили за допомогою програмного заморожувача УОП-6 виробництва СКТБ з ДВ ІПКіК НАН України (швидкості охолодження 1 та 10 єС/хв) до температури -70єС з наступним перенесенням в рідкий азот; зануренням поліетиленового контейнера або контейнера з алюмінієвої фольги в рідкий азот (швидкості охолодження 100 та 1000єС/хв відповідно) та за допомогою пристрою для заморожування біологічних об'єктів (8000 та 80000єС/хв), який дозволяє отримувати високі швидкості охолодження (Патент РФ № 1655426). Заморожений матеріал зберігали в рідкому азоті.

Матеріал відігрівали на водяній бані з температурою 37 – 40єС. Фрагменти відмивали від ПЕО-400 та ПЕО-1500 фізіологічним розчином, а від гліцерину та ДМСО - розчином сахарози тієї ж молярної концентрації що і кріопротектор.

Інтенсивність дихання вимірювали полярографічним методом (Е.Н. Мохова, 1978) на полярографі фірми Radelkis (Угорщина) в нмоль О2/хв/ мг тканини, швидкість відновлення фериціаніду калію - спектрофотометрично при довжині хвилі 420 нм (Л.Д. Лукьянова и др., 1982).

Екстракти одержували з нативних або кріоконсервованих фрагментів органів шляхом їх інкубації в фізіологічному розчині. Екстракти для дослідження молекулярно-масового розподілу пептидів отримували з фрагментів органів, кріоконсервованих в присутності 10%-го ПЕО-1500 зі швидкістю охолодження 1°С/хв. Ці ж екстракти використовували і в інших експериментальних дослідженнях.

Загальну концентрацію білків в екстрактах визначали модифікованим методом Лоурі (І.П. Кайдашев, 2003), концентрацію пептидів і нуклеотидів – спектрофотометричним методом при довжині хвилі 280 і 260 нм відповідно (Д. Уильямс, 1978). Молекулярно-масовий розподіл низькомолекулярних фракцій пептидної природи досліджували методом високоефективної гельпроникаючої хроматографії (Б.В. Столяров и др., 1998).

Для моделювання експериментального цукрового діабету статевозрілим щурам-самцям масою 180-210 г одноразово під шкіру вводили алоксан-моногідрат (ICN Biomedical Inc.) в дозі 130 мг/кг маси тіла тварини після попереднього 24-годинного голодування при вільному доступі до води. Критерієм цукрового діабету була концентрація глюкози в крові не менше 9 ммоль/л (А.С. Ефимов и др., 1981).

Токсичний гепатит викликали одноразовим уведення в черевну порожнину 40%-го розчину тетрахлорметану на вазеліновій олії в дозі 0,4 мл/100 г маси тіла тварини (І.П. Кайдашев, 2003). Цироз печінки моделювали введенням під шкіру 40%-го розчину тетрахлорметану в олії з персикових кісточок у дозі 0,2 мл на 100 г маси тіла тварин два рази на тиждень (Н.Х. Абдулаев и др., 1989). Всього було зроблено 16 ін'єкцій.

Термічний опік шкіри моделювали на щурах лінії Вістар масою 180 - 210 г (Б.А. Парамонов и др., 2002). Під поверхневим ефірним наркозом видаляли шерсть на спині. Опік викликали мідним аплікатором з діаметром 10 мм і температурою 100°С, експозиція - 40 сек.

Експериментальною моделлю росту пухлини була аденокарцинома Герена, штам якої був наданий Інститутом експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Трансплантацію пухлини проводили шляхом підшкірного уведення 0,5 мл 20%-ї суспензії клітин пухлини (Н.Е. Узленкова, 2002).

Дослідження впливу препарату при хронічному уведенні (1 раз на місяць) протягом року проводили на щурах лінії Вістар починаючи з 6-місячного віку. Старим щурам, тобто тим, які досягли 24-місячного віку, уводили суміш екстрактів протягом десяти діб.

Процеси вільнорадикального окислення оцінювали хемілюмінесцентним методом. Рівень перекисного окислення ліпідів визначали за рівнем ТБКАП в сироватці крові та тканинах органів спектрофотометричним методом (при довжині хвилі 532 нм), використовуючи стандартні методики (А.В. Арутюнян и др., 2000; С.Е. Овсянников и др., 1996).

Фрагменти підшлункової залози культивували в середовищі такого складу: 80% середовища 199, 10% ЕТС, 5% гідролізату лактальбуміна, 5% середовища Ігла, пеніцилін і стрептоміцин із розрахунку по 100 од/мл (Б.К. Гаврилюк, 1983). Вміст інсуліну в середовищі культивування визначали радіоімунологічним методом за допомогою наборів РИО-ИНС-ПГ-125J (м. Мінськ, Білорусь). Рівень глюкози в сироватці крові встановлювали натще хромооксигеназним методом з використанням набору фірми "Lachema" (Чехія). Активність АлАТ та АсАТ досліджували з використанням стандартних наборів АО „Реагент" (м. Дніпропетровськ).

Для гістологічного аналізу шматочки тканини фіксували в 10%-му нейтральному формаліні з подальшою заливкою в парафін. Одержані з парафінових блоків зрізи завтовшки 6-8 мкм фарбували гематоксиліном і еозином (О.В. Волкова и др., 1982). Мікрогемоциркуляцію в печінці вивчали методом вітальної мікроскопії за допомогою контактного мікроскопа Люмам К-1 (И.В. Слета, 2002).

Площу ран встановлювали планіметричним методом (І.П. Кайдашев, 2003). Для визначення ступеня обсіменіння рани і видової приналежності мікроорганізмів з поверхні рани відбирали біоптати та робили мазки. Виділення та ідентифікацію аеробної і анаеробної мікрофлори проводили за стандартними методиками (М.И. Кузин и др., 1990; Н.К. Коваленко и др., 2000).

Loading...

 
 

Цікаве