WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Канали KV-групи інтернейронів культури клітин гіпокампа (автореферат) - Реферат

Канали KV-групи інтернейронів культури клітин гіпокампа (автореферат) - Реферат

В іншому варіанті постановки досліду ми реєстрували ГАМК-ергічні постсинаптичні струми в нейроні культури при локальній електричній стимуляції аксону, який має синаптичні закінчення на сомі обраної клітини. Зона аплікації речовин в цьому випадку захоплювала місце локальної стимуляції. Частота стимулів в серії була підібрана досить високою для того, щоб можна було візуалізувати ефект дії ретигабіну, але така, щоб на кожний викликаний ПД можна було відокремити чітку постсинаптичну відповідь. З використанням локальної електричної стимуляції дія ретигабіну була перевірена на 5 нейронах культури клітин гіпокампа. В контрольних умовах після кожного стимулу аксона спостерігалась поява гальмівного постсинаптичного струму в мембрані нейрона. При аплікації ж ретигабіну в концентрації 15 мкмоль/л і при незмінних умовах стимуляції кількість постинаптичних струмів була суттєво меншою завдяки появі тривалих пропусків відповідей на протязі протоколу стимуляції. Цей ефект ретигабіну був зворотнім, після відмивання кількість відповідей повністю відновлювалась. Амплітуда першої постсинаптичної відповіді у серії в контролі і в присутності ретигабіну залишалась незмінною (Рис. 10).

Обговорення. Наші результати показали, що інтегральний потенціал-керований калієвий струм, притаманний гальмівним інтернейронам культури гіпокампа, є багатоскладовим, і в ньому виявляються принаймні три компонента: струм зі швидкою інактивацією А-типу, струм затриманого випрямлення і струм без інактивації, який за кінетичними параметрами близький до М-струму.

Виміряний нами потенціал активації інтегральних калієвих струмів гальмівних інтернейронів знаходився в районі –50 мВ. Виключаючи канали зі швидкою інактивацією, можлива участь яких в формуванні калієвих струмів інтернейронів гіпокампа буде обговорена нижче, такий потенціал активації властивий калієвим каналам Kv1-родини, які мають повільну інактивацію, та Kv7- (KCNQ-) родини, які не мають інактивації (Coetzee et al., 1999; Passmore et al., 2003). Наша задача стояла в тому, щоб відокремити внесок в сумарний струм каналів Kv1- і Kv7-родин, що ми зробили за допомогою DTX, який в наномолярних концентраціях є селективним блокатором Kv1-каналів (Robertson et al., 1996; Scott et al., 1994; Tytgat et al., 1995). Наші досліди з використанням цього блокатора в концентрації 100 нмоль/л і 1 мкмоль/л не дозволили нам виявити жодних компонентів, зі швидкою чи повільною інактивацією, чутливих до DTX. З останнього можна зробити висновок про відсутність Kv1-каналів на сомах ГАМК-ергічних нейронів гіпокампа, що є першою виявленою відмінністю між гіпокампальними принциповими і гальмівними нейронами. Примітно, що відсутність каналів Kv1-родини не є загальною рисою ГАМК-ергічних інтернейронів головного мозку, оскільки, наприклад, є свідоцтва про блокуючий вплив DTX на ГАМК-ергічну передачу в нейронах енторинальної кори (Cunningham and Jones, 2001).

З претендентів на проведення струму затриманого випрямлення в досліджуваних нами клітинах залишились канали Kv2- і Kv3-родин. Потенціал активації цих каналів знаходиться в районі –20 –10 мВ (Coetzee et al., 1999). Той факт, що потенціал активації інтегрального струму в наших дослідах знаходився в районі –50 мВ, а не зсувався до більш позитивних значень, і відсутність суттєвого перегину вольт-амперних кривих сумарного струму в районі –20 –10 мВ, говорив про те, що внесок Kv2- і/або Kv3-каналів не міг бути значним. Збільшення тривалості деполяризуючого стимулу в протоколі стимуляції з 200 мс до 6,5 с виявило в інтегральному калієвому струмі інтернейронів компонент з повільною інактивацією. Постійна часу інактиваційного спаду цього компонента дорівнювала в середньому 3 с, що, виключаючи канали Kv1-родини, є характерним для каналів Kv2- та Kv3-родин (Coetzee et al., 1999). Але, як нами і очікувалось, виявлений компонент з інактивацією складав в середньому 17% від амплітуди сумарного струму, більшу ж частину струму складав постійний компонент, що не мав інактивації.

Багатьма авторами показано, що однією з особливостей інтернейронів є висока експресія каналів Kv3-родини, які вважаються необхідною умовою для здатності клітин до високочастотної генерації ПД і найбільш притаманні парвальбумін-вмісним інтернейронам (Lien and Jonas, 2003; Martina et al., 1998; Tansey et al., 2002). Опираючись на ці дані, можна припустити, що за виявлений в наших експериментах компонент калієвого струму з повільною інактивацію в інтернейронах, які були здатні генерувати ПД з високою частотою, відповідали канали саме Kv3-родини. З іншого боку, досліджені нами інтернейрони, які генерували ПД з невеликою частотою, також мали компонент струму з повільною інактивацією, при чому нами не було помічено достовірної різниці в кінетиці інтегральних струмів між нейронами з різним типом генерації ПД. Можливо, в інтернейронах гіпокампа, які не здатні генерувати ПД з високою частотою, за струм затриманого випрямлення відповідають Kv2-канали, оскільки вони близькі за кінетикою інактивації до Kv3-каналів, а останні вважаються невластивими для даних клітин.

Досліди з відокремленням струму зі швидкою інактивацією А-типу показали його наявність на всіх досліджених нами клітинах, але його амплітуда виявилась досить мала в порівнянні з сумарними калієвими струмами: вона складала в середньому 9,41,3% від сумарного струму, що корелює з результатами інших авторів (Chikwendu and McBain, 1996; Fan and Wong, 1996). Цей факт виявляє чергову суттєву відмінність між пірамідними нейронами гіпокампа і ГАМК-ергічними інтернейронами: в пірамідних нейронах А-струм складає біля 50% сумарного вихідного струму при деполяризації (Birnbaum et al., 2004; Martina et al., 1998).

Кінетичні характеристики, виміряні для А-струму в наших експериментах, співпадали з відповідними відомими характеристиками калієвих каналів зі швидкою інактивацією. Наявність струму А-типу може бути обумовлена роботою декількох різних каналів: Kv1.4-підтипу, Kv3.4-підтипу і/або каналів Kv4-родини (Velasco et al., 1998; Wang et al., 2004; Yuan et al., 2005). Участь Kv1.4, як вже відмічалось вище, була виключена нами у зв'язку з нечутливістю досліджуваних струмів до DTX. Для виявлення можливого внеску каналів Kv3.4 і Kv4.1-Kv4.3 підтипів в формування А-струму ми скористались блокатором 4-АП в низьких концентраціях. Концентрація половинного пригнічення Kv3.4-каналів для цього блокатора складає 0,5-0,6 ммоль/л, в той час як концентрація половинного пригнічення каналів Kv4 дорівнює 5 10 ммоль/л (Coetzee et al., 1999; Kiss et al., 2002). Оскільки 4-АП в концентрації 1 ммоль/л в наших дослідах не виявляв ніякого впливу на струм зі швидкою інактивацією, це дозволило нам прийти до висновку, що цей струм на гальмівних інтернейронах гіпокампа пов'язаний з роботою каналів саме Kv4-родини. Аналогічні результати були показані іншими авторами на пірамідних нейронах, де виявлена наявність А-струму, що обумовлений роботою каналів Kv4-родини, але не каналів Kv1.4-підтипу (Kirichok et al., 1998).

Таким чином, підсумовуючи викладені вище результати, ми прийшли до висновку, що більшу частину інтегрального потенціал-керованого калієвого струму гальмівних інтернейронів гіпокампа складає струм, який обумовлений роботою каналів, що не мають часової інактивації. Також на мембрані цих інтернейронів присутні канали Kv4-родини зі швидкою інактивацією і канали з повільною інактивацією Kv2- і/або Kv3-родин. Але внесок останніх в інтегральний калієвий струм досліджених клітин порівняно незначний. Тому подальші наші зусилля були зосереджені на відокремленні і вивченні струму, що не має часової інактивації, і ідентифікація каналів, активація яких призводить до його появи.

Оскільки будь-яка клітина, що обиралась для дослідження, виявляла наявність струму, що не інактивувався з часом, це підтвердило нас у думці, що саме цей струм є основним компонентом у калієвій відповіді інтернейронів на деполяризацію. На користь цього говорило також те, що потенціал активації стаціонарного струму знаходився в районі 60 мВ, що було близько до виміряного потенціалу активації інтегрального калієвого струму.

На сьогоднішній день єдиним калієвим струмом, що активується при деполяризації клітинної мембрани і не інактивується з часом, вважається М-струм, чи струм, обумовлений роботою каналів Kv7-родини (Marrion, 1997). За даними літератури потенціал активації Kv7-каналів знаходиться в районі –60 мВ (Selyanko et al., 2001; Selyanko and Brown, 1999), що цілком співпадає з виміряним нами для струму, що не мав інактивації, на гальмівних інтернейронах. Постійні часу деактиваційного спаду дослідженого нами струму дорівнювали в середньому 22 і 306 мс, що також дуже близько до відомих постійних часу деактивації М-струму (Pan et al., 2001; Passmore et al., 2003). Все це дозволило нам припустити, що калієвий струм, який реєструвався нами на гальмівних інтернейронах і який не мав інактивації, є М-струмом, обумовленим роботою Kv7-каналів. Для перевірки цього ми використали специфічні блокатори і активатор М-струму. Аплікація блокаторів у концентраціях, що у десять разів перевищують відомі концентрації половинного пригнічення для Kv7-каналів, не призводила до будь-яких змін дослідженого стаціонарного струму. Однак аплікація активатора РТ у робочих концентраціях призводила до збільшення амплітуди стаціонарного струму і до специфічного зсуву його вольт-амперної характеристики до зони більш негативних потенціалів, що є відомою характерною реакцією Kv7-каналів на дію РТ (Tatulian et al., 2001).

Loading...

 
 

Цікаве