WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Канали KV-групи інтернейронів культури клітин гіпокампа (автореферат) - Реферат

Канали KV-групи інтернейронів культури клітин гіпокампа (автореферат) - Реферат

Була перевірена дія на струм без інактивації селективних блокаторів каналів Kv7-родини лінопірдину (ЛП) і XE991 та селективного активатора Kv7-каналів ретигабіну (РТ).

Дію ЛП було досліджено на 16 нейронах, XE991 на 5 нейронах. Концентрації блокаторів були підібрані такі, що приблизно у 10 разів перевищують відомі концентрації половинного пригнічення для Kv7-каналів. Обидва блокатори не спричиняли достовірного зменшення амплітуди вихідного струму (Рис. 5). Збільшення концентрації ЛП до 80 мкмоль/л також не призводило до появи ефекту.

А

Б

В

Г

Д

***

***

***

***

***

*

Рис. 5 Дія на струм, який не інактивується, речовин, специфічних до каналів Kv7-родини. Зверху наведені приклади записів струму в контролі (А), в присутності 50 мкмоль/л лінопірдину (Б) та в присутності 15 мкмоль/л ретигабіну (В) (стрілками помічений нульовий рівень струму). Знизу представлені вольт-амперні характеристики струму в контролі ( ), в присутності ЛП ( ■ ) чи РТ ( ● ) (Г, n=16), в присутності XE991 ( ■ )(Д,, n=5) та після відмивання ( ∆ ) (струми нормовані за максимальною амплітудою в контролі, дані представлені як середнєдовірчий інтервал).

Аплікація РТ у концентрації 15 мкмоль/л достовірно та зворотно зміщувала вольт-амперну характеристику струму, що не має часової інактивації, до більш негативних потенціалів. Амплітуда струму при потенціалі –20 мВ при аплікації РТ зростала на 6614% у порівнянні з контролем (n=16) (Рис. 5). Оскільки такий вплив РТ є відомим результатом його специфічної дії на Kv7-канали, це дозволило нам стверджувати, що саме їх робота обумовлює наявність струму, що не має інактивації, на гальмівних інтернейронах гіпокампа. Але нечутливість цього струму до селективних блокаторів каналів Kv7-родини вимагало від нас подальших досліджень з метою надійної ідентифікації типу калієвих каналів, що відповідні за наявність зареєстрованого струму.

Імунофлуоресцентне забарвлення гальмівних інтернейронів культури клітин гіпокампа на наявність Kv7.2-каналів. Імунофлуоресцентне забарвлення показало, що кожен з 20 досліджених інтернейронів експресував калієві канали Kv7.2-підтипу. При цьому забарвлення в більшому ступені проявлялось на сомі клітин, а не на їх відростках, і його інтенсивність дещо варіювала від нейрона до нейрона (Рис. 6).

.

Рис. 6 Культивовані інтернейрони гіпокампа при імунофлуоресцентному забарвленні на вміст Kv7.2-рецепторів. Зверху – мікрофотографії інтернейронів, зняті в режимі фазового контрасту; знизу – мікрофотографії тих самих клітин, які флуоресцують після забарвлення

Виявлення мРНК -субодиниць Kv7-каналів в нейронах культури клітин гіпокампа методом ЗТ ПЛР. Наступний метод, який був нами використаний для дослідження Kv7-каналів в гіпокампі – це ЗТ ПЛР, за допомогою якого ми встановлювали наявність матричних РНК (мРНК) Kv7.2, Kv7.3, Kv7.4 і Kv7.5 субодиниць. Kv7.1 субодиниця була нами виключена з дослідження, оскільки, як вважається, вона не властива нервовим структурам (Barhanin et al., 1996; Delmas and Brown, 2005; Schroeder et al., 2000).

ЗТ ПЛР цілого гіпокампа новонародженого і 21-денного щурів показав наявність мРНК всіх чотирьох Kv7-субодиниць, що тестувались, хоча кількість ПЛР-продукту Kv7.4-субодиниці була значно меншою в порівнянні з іншими. Суттєвої різниці у експресії Kv7-субодиниць у гіпокампах новонародженого і 21-денного щурів виявлено не було.

В сумарній РНК трьохтижневої культури нейронів гіпокампа щура також була виявлена досить висока експресія Kv7.2, Kv7.3 і Kv7.5 субодиниць, але, разом з тим, відсутність експресії Kv7.4 субодиниці.

Для виявлення експресії Kv7-каналів в одиничних гальмівних інтернейронах кожна клітина, що обиралась для дослідження, спочатку бралась у електрофізіологічний дослід, в якому визначалась її належність до гальмівних інтернейронів, встановлювався тип її електричної активності і реєструвались властиві їй потенціал-керовані калієві струми. По закінченні електрофізіологічного досліду цитоплазма клітини вилучалась у петч-піпетку і переносилась до пробірки з сумішшю для ЗТ, після чого з нею проводилась вся послідовність реакцій ЗТ ПЛР.

У всіх 42 тестованих клітинах було показано високий рівень експресії Kv7.2-субодиниці та дещо менший рівень експресії Kv7.3-субодиниці. У 16 з 42 клітин було виявлено експресію Kv7.5-субодиниці, але її рівень був значно менший за рівень експресії Kv7.2- і Kv7.3-субодиниць. В жодному з тестованих інтернейронів не було виявлено наявності мРНК Kv7.4-субодиниці (Рис. 7).

Рис. 7 Приклади продуктів полімеразної ланцюгової реакції з восьми (1-8) одиничних гальмівних інтернейронів культури гіпокампа. Для кожної клітини показано результат реакції на виявлення наявності мРНК Kv7.2 (А), Kv7.3 (Б), Kv7.4 (В) та Kv7.5 (Г) cубодиниць калієвих каналів.

Дія РТ на потенціал спокою гальмівних інтернейронів і на формування ними потенціалів дії. Для того, щоб перевірити можливу участь Kv7-каналів у формуванні мембраною інтернейронів потенціалів спокою та дії, була перевірена дія РТ не тільки на струми, що не активуються, а і на потенціали мембрани інтернейронів в умовах фіксації струму. Аплікація РТ в концентрації 15 мкмоль/л достовірно (р0,001) і зворотно змінювала потенціал спокою будь-якого з досліджених нейронів на –11,7  0,9 мВ (n=16). Крім того, РТ суттєво зменшував кількість ПД в серії, що виникала у відповідь на тривалий деполяризуючий поштовх струму (Рис. 8). Цей ефект РТ також мав зворотну дію і був справедливий як для інтернейронів, що генерували ПД з високою частотою, так і для тих, що генерували ПД з невисокою частотою. З метою виключення можливості того, що вплив РТ на генерацію ПД в наших дослідах був пов'язаний з його дією на ГАМК-рецептори, на чотирьох клітинах була перевірена сумісна дія аплікації РТ і селективного блокатору ГАМК-рецепторів бікукуліну. Аплікація РТ на фоні бікукуліну призводила до зменшення кількості ПД у викликаній серії, аналогічного до дослідів з відсутнім ГАМК-блокатором.

Дія РТ на проведення ПД в аксонах гальмівних інтернейронів. Здатність ретигабіну пригнічувати викликану серію ПД на інтернейронах гіпокампа навела нас на думку, що ця його властивість може дозволити нам встановити наявність KCNQ-каналів на аксонах гальмівних інтернейронів і можливість їх участі в модуляції ГАМК-ергічної синаптичної передачі.

А

Б

В

Рис. 8 Серії ПД, викликані деполяризуючим імпульсом струму, інтернейрона, що генерував ПД з високою частотою (зверху) та інтернейрона, що генерував ПД з невисокою частотою (знизу) в контролі (А), в присутності 15 мкмоль/л РТ (Б) та після відмивання (В).

Перший методичний підхід, який ми використовували – локальна аплікація ретигабіну в умовах реєстрації потенціалів і струмів від двох синаптично зв'язаних нейронів культури гіпокампа. При цьому на пресинаптичному нейроні в умовах фіксації струму деполяризуючим імпульсом викликалась серія ПД, а на постсинаптичному нейроні в умовах фіксації потенціалу реєструвались відповідні ПД постсинаптичні струми. Пари нейронів були

Рис. 9 Викликані серії ПД на пресинаптичному інтернейроні та відповідні постсинаптичні струми на постсинаптичному нейроні в контролі (А), в присутності 15 мкмоль/л РТ (Б) та після відмивання (В). Зверху (1) – реєстрація при локальній аплікації на зону пресинаптичного нейрона, знизу (2) - при локальній аплікації на зону постсинаптичного нейрона.

підібрані таким чином, щоб аплікацію речовин можна було здійснювати окремо або на сому пресинаптичного нейрона, або на дистальні частини його аксону. Ідея полягала в тому, що якщо на дистальній частині аксону присутні канали Kv7-родини, то їх активація ретигабіном, можливо, буде запобігати розповсюдженню серії ПД. При цьому ми спостерігали б повноцінну серію ПД на сомі пресинаптичного нейрона, але кількість постсинаптичних відповідей на постсинаптичному нейроні була б значно меншою. Дія ретигабіну була перевірена на 8 парах синаптично зв'язаних клітин. Аплікація ретигабіну в концентрації 15 мкмоль/л на сому пресинаптичної клітини, як і при реєстрації від однієї клітини, значно зменшувала кількість ПД у викликаній серії, що відповідним чином відображалось і на формі постсинаптичної відповіді (Рис. 9). Однак аплікація ретигабіну в концентрації 15 мкмоль/л на дистальну частину аксона пресинаптичного нейрона достовірно не змінювала постсинаптичну відповідь (Рис. 9).

Рис. 10 Гальмівні постсинаптичні струми нейрона гіпокампа у відповідь на локальну електричну стимуляцію аксону, що приходить на цей нейрон, в контролі (А), в присутності 15 мкмоль/л РТ (Б, В) та після відмивання (Г). Зверху наведений протокол стимуляції аксону, вертикальні риски відповідають стимулам.

Loading...

 
 

Цікаве