WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Канали KV-групи інтернейронів культури клітин гіпокампа (автореферат) - Реферат

Канали KV-групи інтернейронів культури клітин гіпокампа (автореферат) - Реферат

Зворотна транскрипція і полімеразна ланцюгова реакція були використані для виявлення експресії каналів родини Kv7 в цілому гіпокампі, в культурі нейронів гіпокампа і в одиничних культивованих гальмівних інтернейронах культури гіпокампа за методом, детально описаним раніше (Shah et al., 2002). Були використані „інтрон-стягуючі" праймери, синтезовані таким чином, щоб вони перекривали ділянки інтронів в нуклеотидній послідовності генів, кодуючих Kv7.2 - Kv7.5 субодиниці рецепторів:

KCNQ2 (2900s): АГТГЦГГАТЦАГАГТЦТЦ;

KCNQ2 (3126a): ГТЦЦТГАТГЦТГАЦТТТГАГГЦ;

KCNQ3 (746s): ЦАГЦАААГААЦТЦАТЦАЦЦГ;

KCNQ3 (906a): АТГГТГГЦЦАГТГТГАТЦАГ;

KCNQ4 (40s): ЦЦЦТЦЦААГЦАГЦАТЦТГ;

KCNQ4 (420a): ТТГАТТЦГТЦЦЦАГЦАТГТЦТА;

KCNQ5 (995s): ГГААЦЦЦАГЦТГЦЦААЦЦТЦАТ;

KCNQ5 (1101a): ЦТТТЦТТГГТАГГГЦТГЦАГ.

Аналіз даних. Параметри калієвих і постсинаптичних струмів (амплітуда, постійна часу інактивації) і потенціалів дії (частота, поріг виникнення, тривалість) визначались за допомогою програмного пакету Clampfit 9.0 („Axon Instruments", США). Подальша обробка і представлення результатів, включаючи статистичний аналіз, проводилась за допомогою електронних таблиць Microsoft Excel („Microsoft", США). Величини представлені в тексті як "середнє значення" "середньоквадратична похибка середнього (S.E.M.)", після чого у дужках наведено розмір вибірки, за якою проводилось усереднення. Для визначення статистичної достовірності різниці між середніми значеннями двох груп даних було використано t-тест Ст'юдента. Рівень значущості критерію на малюнках позначено наступним чином: * P <0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001.

Продукти ПЛР-ампліфікації аналізувались візуально після проведення електрофорезу в агарозному гелі. Результати імуноцитохімічного забарвлення аналізувались візуально за допомогою мікроскопа Axiovert 200.

У розділі Результати викладено результати досліджень експресії різних підтипів калієвих каналів в ГАМК-ергічних інтернейронах культури гіпокампа, їх участі в формуванні калієвого струму, що виникає в клітинах у відповідь на деполяризацію, можливості впливу винайдених каналів на гальмівну синаптичну передачу.

Калієві струми, що виникали у відповідь на деполяризацію клітинної мембрани, були досліджені на 88 гальмівних інтернейронах культури гіпокампа. Кожний окремий дослід був пов'язаний з необхідністю достовірно ідентифікувати гальмівні інтернейрони в умовах культури. Для цього використовувалось імуноцитохімічне забарвлення на вміст глутаматдекарбоксилази, при якому в розгляд брались тільки позитивно забарвлені нейрони, чи електрофізіологічні властивості, як то здатність нейрона генерувати ПД з великою частотою або наявність гальмівного постсинаптичного струму від "аутапсу". У 43 з досліджених нейронів було встановлено тип їх електричнної активності, з яких 21 клітина генерувала ПД з високою частотою, 22 відповідали на деполяризуючий поштовх струму серією ПД з невисокою частотою. Нейрони першої групи були здатні генерувати 20 35 ПД протягом 500 мс стимуляції з напівшириною поодинокого ПД 0,7 1,2 мс. Клітини другої групи генерували протягом стимуляції 8 18 ПД з напівшириною поодинокого ПД 1,35 1,8 мс (Рис. 8, А).

Інтегральний потенціал-керований калієвий струм гальмівних інтернейронів культури гіпокампа. На всіх досліджуваних нейронах стандартний протокол стимуляції інтегрального калієвого струму викликав появу вихідного струму з максимальною амплітудою від 1 до 7 нА при потенціалі +60 мВ (Рис. 1, А). Його щільність при деполяризації мембрани від 110 до +60 мВ для всіх досліджених інтернейронів складала 23,2  2,7 пА/пФ (n=32). При цьому середня щільність для інтернейронів, що генерували ПД з невисокою і високою частотою складала 22,34,1 пА/пФ (n=12) і 23,63,2 пА/пФ (n=20) відповідно.

На всіх досліджених клітинах на протязі 180 мс інтервалу стимуляції інактивація струму практично не спостерігалась (Рис. 1, А).

Для того, щоб відокремити складову струму, що не інактивується і струму, що інактивується повільно, на 8 нейронах були проведені експерименти за допомогою стимуляційного протоколу, в якому тривалість деполяризуючого стимулу була подовжена до 6,5 с (Рис. 1, Б). Спад струмів добре апроксимувався однією експонентою з постійною часу 3,0  0,2 с (n=8). Компонент струму, що не мав інактивації, складав 83,1  1,7% (n=8) від максимальної амплітуди сумарного струму.

А

Б

Рис. 1. Оригінальний запис інтегрального калієвого струму, викликаного ступінчатою деполяризацією, при використанні стандартного протоколу стимуляції (А) і протоколу з тривалими деполяризуючими зсувами потенціалу (Б) у інтернейронів культури клітин гіпокампа. Зверху наданий протокол стимуляції.

Екстраполюючи вольт-амперну криву сумарного струму до перетину з віссю абсцис (Рис. 2), ми встановили його потенціал активації, який приблизно дорівнює –50 мВ.

Рис. 2 Усереднені вольт-амперні характеристики сумарного калієвого струму інтернейронів гіпокампа, викликаного деполяризацією, в контролі ( ), в присутності 100 нмоль/л ( ■ ) (А, n=12) та 1мкмоль/л ( ■ ) (Б, n=4) -дендротоксину та після відмивання ( ∆ ). Амплітуди струмів нормовані за максимальним контрольним рівнем.

Калієві канали Kv1 родини в гальмівних інтернейронах гіпокампа Для перевірки внеску Kv1-каналів в сумарний калієвий струм інтернейронів був проведений ряд експериментів з використанням -дендротоксину (DTX), що є специфічним блокатором Kv1 каналів з концентрацією половинного пригнічення для більшості з них 10 30 нМ. На 12 гальмівних інтернейронах культури клітин гіпокампа була перевірена дія DTX у концентрації 100 нмоль/л на сумарний калієвий струм. Як видно з вольт-амперних характеристик (Рис. 2), аплікація блокатора не призводила до вірогідної зміни амплітуд вихідних струмів. Десятикратне підвищення концентрації DTX не призводило до жодних змін ефекту його дії.

Б

А

В

Рис. 3 Оригінальні записи швидкого калієвого струму А-типу в контролі (А) і в присутності 1 ммоль/л 4-амінопіридину (Б) та відповідні вольт-амперні характеристики (В) в контролі ( ) і в присутності блокатора ( ■ ). Амплітуди на (В) нормовані за максимальним контрольним рівнем, дані представлені як середнєдовірчий інтервал, n=6.

Швидкий калієвий струм А-типу гальмівних інтернейронів. На всіх досліджуваних нейронах, незалежно від характеру генерації їх ПД, виявлявся швидкий вихідний струм, що за кінетичними параметрами був віднесений до А-струму. Його амплітуда складала 9,1  1,3% (n=15) від амплітуди інтегрального вихідного струму. Крива його інактиваційного спаду добре апроксимувалась однією експонентою з постійною часу, яка мала потенціал-залежний характер. При потенціалах +50 +60 мВ постійна часу інактивації дорівнювала 14,0  1,1 мс (n=12). Потенціал активації А-струму знаходився в районі –50 мВ (Рис. 3).

На шести нейронах було перевірено дію 4-амінопірідину (4-АП) на А-струм. Як видно з Рис. 3, 4-АП в концентрації 1 ммоль/л не спричиняв вірогідного впливу на швидкий калієвий струм. Цей результат, разом з результатами експериментів з DTX, дозволяє стверджувати, що А-струм в цих клітинах обумовлений роботою каналів виключно Kv4-родини.

Калієвий струм гальмівних інтернейронів, що не має часової інактивації. Для відокремлення струмів, що не мають часової інактивації, використовувався стандартний деактиваційний протокол стимуляції (Brown and Adams, 1980). На всіх досліджених нейронах при тривалій деполяризації до –20 мВ виявлявся вихідний струм, що мав амплітуду 100 500 пА (Рис. 4). Його вольт-амперна характеристика мала потенціал-залежний характер і показала потенціал його активації приблизно –60 мВ (Рис. 4). Деактиваційні криві цього струму добре апроксимувались двома експонентами з постійними спаду 223,1 мс та 30640 мс (n=32) при зміні потенціалу від –20 до –50 мВ. За встановленими характеристиками виявлений калієвий струм можна віднести до М-струму, який є результатом активації каналів Kv7 (KCNQ) родини. Достовірної різниці у струмі без інактивації між нейронами, що генерують ПД з високою та невисокою частотою, не виявлено.

А

Б

Рис. 4 Калієвий струм інтернейронів гіпокампа, що не має інактивації, зареєстрований від окремого інтернейрона (А) (стрілкою позначений нульовий рівень струму, зверху показаний деактиваційний протокол стимуляції) та усереднена вольт-амперна характеристика струмів, що не мають інактивації, в інтернейронах гіпокампа (Б) (струми нормовані за максимальною амплітудою, дані представлені як середнєдовірчий інтервал, n=20)

Loading...

 
 

Цікаве