WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Канали KV-групи інтернейронів культури клітин гіпокампа (автореферат) - Реферат

Канали KV-групи інтернейронів культури клітин гіпокампа (автореферат) - Реферат

Апробація результатів дисертації. Загальні положення роботи доповідались на поточних наукових семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (Київ, 2006 р.), та наступних наукових конференціях: Конференція для молодих вчених "Актуальні проблеми фармакології та токсикології" (22 грудня 2005 р., Київ, Україна); ІІІ Всеукраїнська наукова конференція "Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології" (4-6 жовтня 2006 р., Київ, Україна); ІV з'їзд Українського біофізичного товариства (19-21 грудня 2006 р., Донецьк, Україна).

Публікації. Результати роботи опубліковано в 3 статтях у наукових фахових журналах та тезах 3 доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, методів досліджень, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 177 найменувань. Роботу викладено на 141 сторінці та ілюстровано 38 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

У Вступі обґрунтовано актуальність дослідження потенціал-керованих калієвих каналів в нервових структурах, зокрема в гіпокампі, ролі цих каналів в забезпеченні функціонування нейронів і в модуляції синаптичної передачі, сформульовано мету та задачі дослідження, наведено відомості про наукову новизну, практичне значення та апробацію отриманих результатів, публікацію матеріалів дисертації.

В розділі Огляд літератури розглянуті відомі на сьогодні потенціал-керовані калієві канали, їх структура і функціонування, розподіл в різних органах і тканинах організму, а також будова і функції гіпокампа.

Для досягнення поставленої мети у розділі Методика досліджень описано використані матеріали та методи досліджень, а саме:

  1. приготування первинної культури дисоційованих нейронів гіпокампа низької щільності;

  2. методика фіксації потенціалу в конфігурації "ціла клітина";

  3. методика парної реєстрації потенціалів і постсинаптичний струмів;

  4. методика позаклітинної електричної стимуляції аксона нейрона;

  5. методика локальної позаклітинної перфузії для аплікації фармакологічних речовин;

  6. методика імуноцитохімічного аналізу;

  7. методика зворотної транскрипції і полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ ПЛР);

  8. статистична обробка отриманих результатів.

Приготування культури дисоційованих нейронів гіпокампа. Новонароджених щурів лінії Вістар декапітували, гіпокамп виділяли та ферментативно обробляли здійснювали 0,025%-м розчином трипсину (тип XII-S, "Sigma", США) при кімнатній температурі (21 24С) протягом 5-6 хвилин. Після механічної дисоціації клітини висівали на вкриті полі-L-орнітином та ламініном ("Sigma", США) чашки Петрі з щільністю 30000 од/см2. Клітини культивувались у середовищі наступного складу: мінімальне середовище Ігла, 10% кінської сироватки, 6 мкг/мл інсуліну, 2,3 мг/мл бікарбонатного буферу NaHCO3, 25 од/мл натрієвої солі бензилпеніциліну та 25 мкг/мл стрептоміцину сульфату в інкубаторі ("Jouan", Франція) з контрольованим вмістом двоокису вуглецю (5% СО2) і температурним режимом (37С) та постійним пасивним зволоженням. На третій день культивування для пригнічення проліферації гліальних клітин в середовище додавали 5 мкмоль/л цитозин-β-D-арабіно-фуранозиду ("Sigma", США). Повторна повна заміна розчину для культивування проводилась через 20 24 години.

Електрофізіологічні експерименти проводились на нейронах, культивованих протягом 18 28 днів, при кімнатній температурі (20 23С). На цей час клітини формували синаптичні контакти, також можна було чітко ідентифікувати морфологічні типи клітин. У розгляд брались бі- та мультиполярні клітини розміром 15-35 мкм. Нейрони трикутної форми та всі клітини з трьома відростками виключались з досліджень у зв'язку з можливою належністю їх до пірамідних нейронів.

Електрофізіологічні методи. Для вимірювання трансмембранних струмів, які відводились від культивованих нейронів гіпокампа, було застосовано метод фіксації потенціалу на обмеженій ділянці клітинної мембрани ("patch-clamp"), який було описано Неєром та Сакманом (Hamill et al., 1981; Neher and Sakmann, 1976). Для всіх досліджень обирались клітини, потенціал спокою яких був не позитивніший за 40 мВ.

Режим фіксації потенціалу використовувався для реєстрації потенціал-керованих калієвих струмів і постсинаптичних струмів. В залежності від конкретної мети і від типів струмів, які необхідно було ізолювати, застосовували різні протоколи підтримання мембранного потенціалу і активації іонних каналів. Величина підтриманого потенціалу коливалась в межах 110 +60 мВ.

Режим фіксації струму використовувався для дослідження специфіки викликаної електричної активності інтернейронів. Досліджуваний нейрон в цьому режимі гіперполяризувався приблизно до –70 мВ. При фіксації струму визначався потенціал спокою досліджуваних клітин і належність їх до певних підтипів нейронів за здатністю генерувати потенціали дії. Серія потенціалів дії викликалась деполяризуючим імпульсом струму тривалістю 500 мс. Амплітуда імпульсів поступово збільшувалась до досягнення такої, при якій кількість потенціалів дії в викликаній серії була максимальною.

Для одночасної реєстрації ПД на пресинаптичній клітині і викликаних постсинаптичних струмів на постсинаптичній використовувались методики фіксації струму і потенціалу в режимі "ціла клітина" відповідно. Для стимуляції пресинаптичної клітини і виклику в неї серії ПД використовувався протокол стимуляції деполяризуючими імпульсами струму. В постсинаптичній клітині при постійно підтримуваному потенціалі на рівні 75 мВ реєструвались відповідні потенціалам дії постсинаптичні струми.

Локальна електрична стимуляція проводилась за допомогою стимулятора з ізольованим виходом ISO-Flex („AMPI", Ізраїль). Стимуляційна мікропіпетка з діаметром отвору близько 2 мкм виготовлялась за технологією аналогічно піпеткам для реєстрації струмів. Викликані постсинаптичні струми реєстрували при подразненні аксона серією прямокутних імпульсів напруги негативної полярності тривалістю 1 мс кожний. Частота стимуляції в серії становила 40 Гц, тривалість кожної серії 500 мс, інтервал між серіями команд складав 5 с. Амплітуда напруги на вході стимуляційної піпетки змінювалась в межах від 20 до 60 В.

Аплікація фармакологічних речовин здійснювалась за методикою швидкої локальної перфузії (Veselovsky et al., 1996).

В експериментах використовувався зовнішньоклітинний розчин наступного складу (ммоль/л): NaCl 140, KCl 3, CaCl2 2, MgCl2 2, Hepes 20, глюкоза 30. Внутрішньоклітинний розчин містив (ммоль/л): К-глюконат 100, KCl 50, EGTA 10, MgCl2 5, HEPES 20. У зовнішньоклітинний розчин додавали блокатори іонотропних глутаматних рецепторів NMDA- та не-NMDA-типів: відповідно DL-2-аміно-5-фосфоновалеріанову кислоту (DL-AP5) и 6,7-динітрохіноксалін-2,3-діон (DNQX) у концентрації 20 мкмоль/л кожен. При реєстрації потенціал-керованих калієвих струмів у перфузуючий розчин включався 1 мкмоль/л тетродотоксину (TTX) для блокування натрієвих каналів і 0,1 ммоль/л хлориду кадмію для блокування кальцієвих каналів. Всі перераховані реактиви були виробництва „Sigma", США. m е____________________________________________________________________________________________________________________________Заповнені розчином, піпетки мали опір 4-6 МОм. Експериментальна установка була зібрана на базі інвертованого мікроскопа Axiovert 200 („Carl Zeiss", Німеччина), який при використанні фазовоконтрастного об'єктиву забезпечував 400-кратне оптичне збільшення. В експериментах використовувався підсилювач електричних сигналів Axopatch-200В („Axon Instruments", США). Сигнали відцифровувались та записувались за допомогою АЦП LabMaster TL-1 та програмного пакету pClamp 6.0 („Axon Instruments", США) з частотою дискретизації 10 кГц. Електричні сигнали, які відводились від нервових клітин, піддавались фільтрації за допомогою високочастотного фільтру Бесселя з частотою зрізу 5 кГц.

Імуноцитохімічне забарвлення проводилось за стандартною методикою (Shah et al., 2002) з використанням антитіл ("Santa Cruz Biotechnology", США), специфічних до глутаматдекарбоксилази чи до досліджуваних підтипів калієвих каналів, після того, як з нейронами був проведений ряд необхідних електофізіологічних тестів. Ідентифікація забарвлених клітин на зафіксованому препараті проводилось шляхом морфологічного порівняння нейронів після забарвлення з їх фотографіями при електрофізіологічних дослідах.

Loading...

 
 

Цікаве