WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Участь тромбоксану в загибелі гепатоцитів щурів в культурі (автореферат) - Реферат

Участь тромбоксану в загибелі гепатоцитів щурів в культурі (автореферат) - Реферат

Забарвлення аутофагічних структур.

Оцінку активності процесів аутофагії в умовах дії ТхВ2 в концентрації 0,1 мкмоль/л проводили за допомогою флуоресцентного барвника монодансилкадаверіна (МДК) фірми "Sigma" у кінцевій концентрації 50 мкмоль/л на протязі 10 хв у темряві за інструкцією виробника. ТхВ2 вносили в культури двічі з інтервалом в 1 год. Через 3 год інкубації з ТхВ2 здійснювали забарвлення МДК. Після відмивання холодним ЗФР (чотири рази), здійснювали прижиттєву оцінку процесів аутофагії, підраховуючи кількість клітин з вираженою гранулярною флуоресценцією, оцінювали забарвлення не менш ніж 200 клітин в кожній культурі. Підраховували кількість клітин з сильним, слабим забарвленням, а також без забарвлення і вираховували їх відсоток.

Представлені дані є результатом трьох-шести незалежних експериментів. В кожному експерименті вплив досліджуваних речовин здійснювали паралельно в триплікатах культур [Munafo D.B., 2001].

Статистична обробка матеріалу проведена з обчисленням критерію Стьюдента [Лакин Г.Ф., 1990].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Характеристика культури гепатоцитів.

За оцінкою методом включення барвника (трипанового синього) кількість виділених живих гепатоцитів перед їх культивуванням складала 84,65,6%. Домішок непаренхіматозних клітин (НПК) в суспензії гепатоцитів, оцінений за морфологічними ознаками, складав при посадці 4,23%1,68% від загальної кількості клітин, тоді як кількість цих клітин у печінці складає -30-40%. Через 18 год після посадки культури гепатоцитів мали вигляд моношару полігональних клітин. Їх можна охарактеризувати, як культури високої щільності, що приблизно відповідає щільності злиття клітин. Гепатоцити розпластувалися та утворювали контакти з сусідніми клітинами. Виявлялися одно-, дво- та багатоядерні гепатоцити. Домішок НПК в культурах гепатоцитів після 18-42 годин культивування складав 0,920,07% від загальної кількості клітин, тобто в процесі прикріплення клітин до колагенового субстрату, їх культивування та відмивання відбувалося подальше очищення культур гепатоцитів від НПК.

Загибель культивованих гепатоцитів щурів та морфологічніознаки клітинної загибелі під впливом екзогенного ТхВ2 за даними люмінесцентної та електронної мікроскопії.

Встановлено, що екзогенний ТхВ2 в кінцевих концентраціях 0,001, 0,01, 0,1 і 1 мкмоль/л за даними люмінесцентної мікроскопії зменшував кількість живих гепатоцитів та підвищував кількість гепатоцитів з морфологічними ознаками апоптозу відповідно в 2,8 (P<0,001), в 2,8 (P<0,01), в 1,6 (P<0,01), в 1,4 (P<0,05) рази по відношенню до контролю через 4 год після внесення ТхВ2. Подібні результати були отримані через 8 та 24 год (дані відносно 0,1 мкмоль/л ТхВ2 представлені в Таблиці 1). Важливо те, що виражені ефекти спостерігалися навіть при наномолярних концентраціях ТхВ2 (0,01 та 0,001 мкмоль/л), які можуть відповідати його концентрації в печінці при фізіологічних умовах або при незначній стимуляції його вивільнення тромбоцитами, гепатоцитами або синусоїдними клітинами печінки. Встановлено, що ТхВ2 суттєво не впливав на інші вивчені шляхи загибелі гепатоцитів, такі як некроз та аутофагію: відсоток клітин, забарвлених флуоресцентним барвником аутофагосом монодансилкадаверином становив в контролі 2,660,7%, за умов дії ТхВ2 2,740,8%.

Ці дані відносно проапоптотичної дії Тх на культивовані гепатоцити щурів отримані вперше. Однак в літературі є непрямі підтвердження таких ефектів Тх: при дії на ізольовані гепатоцити ТхВ2 спричиняв через активацію нелізосомальних протеїназ утворення вип'ячувань плазматичної мембрани (blebs), які вважають характерними для апоптозу [Horton A.A., Wood J.M., 1991, Horton A.A., Wood J.M., 1990]. Подібні до наших даних отримані результати [Yusuf K., et al., 2001, Ushikubi F., et al., 1993] про безпосередній вплив Тх на загибель інших типів клітин (тимоцитів, трофобластів). Однак є дані і про збільшення некротичної загибелі [Beauchamp M.H. et al., 2001]. В цій роботі аналог ТхА2 викликав дозо- і часозалежну смерть нейроретіноваскулярних ендотеліальних клітин щурів, в більшій мірі некротичну, ніж апоптотичну (щоправда автори не оцінювали первинний і вторинний некроз).

В аналізі морфологічних форм загибелі важливо оцінювати цілісність плазматичної мембрани, тобто первинний і вторинний постапоптотичний некроз, що супроводжується виходом клітинного вмісту і розвитком запалення і імунних реакцій in vivo. За морфологічними та біохімічними ознаками розрізняють декілька стадій развитку апоптозу. На основі літературних даних та морфологічної картини апоптозу гепатоцитів при люмінесцентному дослідженні, ми виділили 5 типів апоптозу, враховуючи стадії його розвитку (ранні чи пізні), а також ушкодження плазматичної мембрани, тобто вторинний некроз.

Проведено аналіз кількості окремих типів клітин, що знаходяться на різних стадіях апоптозу. Було виділено такі типи апоптотичних клітин: 1) – гепатоцити з конденсованим ядерним хроматином і незначним зменшенням розмірів, що відповідає раннім морфологічним ознакам апоптозу; 2) суттєво зменшені в розмірах клітини з сильно конденсованими ядрами і, переважно, з

ушкодженою мембраною (клітини, в яких процес апоптозу був перерваний на стадії конденсації ядер); 3) гепатоцити, дещо зменшені в розмірах, з сильноконденсованим і фрагментованим хроматином, зменшене у розмірах ядро зберігає цілісність, мембрана неушкоджена; 4) – гепатоцити з вираженими ознаками апоптозу, як і тип 3, однак з ушкодженою плазматичною мембраною. Ці клітини мають, таким чином, ознаки вторинного некрозу, що відбувся на фоні розвинутого апоптотичного процесу; 5) – гепатоцити, що розпались на апоптотичні тільця, які містять залишки ядерного матеріалу.

Встановлено, що при додаванні в культуру інтактних гепатоцитів ТхВ2 в кінцевих концентраціях 1, 0,1, 0,01 і 0,001мкмоль/л через 4, 8 і 24 год збільшується кількость гепатоцитів з конденсованим хроматином (тип 1), не виявлено значних змін кількості клітин з морфологічними ознаками, що характеризують пізні стадії апоптозу (тип 3, 4 і 5), або постапоптотичного некрозу (тип 2, 4) (Таблиця 2). Ці дані підтверджуються електронно-мікроскопічними дослідженнями: морфологічні зміни, спричинені ТхВ2, виявлялися переважно у ядрі, частково у цитоплазмі, але не у органелах і свідчили про підсилення ранніх стадій апоптозу. Слід відмітити, що в широкому спектрі морфологічних змін за умов захворювань печінки є такі, що співпадають з відміченими нами: каріопікноз, фрагментація ядер, конденсація хроматину, його крайове розташування. Морфологічна форма ядер – "пісочні ядра гепатоцитів" є характерною для деяких видів патології печінки, особливо хронічного вірусного гепатиту [Бабак О.Я., 1999]. Це ядра з периферичним розташуванням конденсованого ядерного хроматину, що співпадає з основною морфологічною формою апоптозу гепатоцитів за умов дії ТхВ2. Як і в наших дослідах, при захворюваннях печінки апоптоз часто супроводжуються процесами вторинного некрозу.

Електронномікроскопічні дослідження показали, що в культурах гепатоцитів, в які вносили ТхВ2 в кінцевих концентраціях 0,1 і 0,01 мкмоль/л протягом 4 год, підвищувалася кількість гепатоцитів із зміненими ядрами. Спостерігалася конденсація хроматину з крайовим його розташуванням (Рис 1б). Конденсований хроматин мав гомогенний вигляд; в його масі інколи відмічалося утворення везикул. Ядра ущільнені, з інвагінаціями. Ядерна мембрана втрачала свою чітку двошарову структуру, однак конденсований хроматин лишався в межах зони ядра, як компактне утворення (Рис 1в). Описані зміни ядер можна віднести до апоптотичних, оскільки при некрозі ніколи не спостерігається пікноз ядер. Ядерця ущільнювалися та зливалися з конденсованим хроматином. Цитоплазма таких клітин ущільнена, осмиофільна, що свідчить про втрату води (Рис 1в). Цитоплазматичні органели таких клітин (мітохондрії, плазматичний ретикулум і комплекс Гольджі) переважно не піддавалися змінам і мали неушкоджений вигляд. Спостерігалося також утворення вип'ячувань цитоплазми (blebs) і відшнурування частин цитоплазми й утворення апоптотичних тілець (Рис 1г).

Рис. 1. Ультраструктура інтактних гепатоцитів (а) та при дії екзогенного ТхВ2 (0,1 мкмоль/л) (б – початкова стадія конденсації хроматину, в – виражена стадія конденсації хроматину, г - утворення вип'ячувань цитоплазми та апоптотичних тілець) через 4 год культивування.

Loading...

 
 

Цікаве