WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Участь тромбоксану в загибелі гепатоцитів щурів в культурі (автореферат) - Реферат

Участь тромбоксану в загибелі гепатоцитів щурів в культурі (автореферат) - Реферат

Наукова новизна одержаних результатів: Вперше показано, що під дією ТхВ2 у культурі гепатоцитів підвищується кількість клітин з морфологічними ознаками апоптозу та відбувається активація каспази 3. Вперше встановлено, що внесення інгібітора утворення мітохондріальних пор циклоспорину А в культури гепатоцитів призводило до зменшення кількості апоптотичних клітин в порівнянні з дією ТхВ2, що свідчить про участь мітохондріального шляху в проапоптотичній дії ТхВ2. Вперше показано, що ТхВ2 посилює апоптоз гепатоцитів за умов їх токсичного ушкодження (ССl4) або ушкодження жовчними кислотами (ХДХК). Вперше охарактеризовано морфологічні форми апоптозу гепатоцитів за умов дії ТхВ2 в нормі та при ушкодженні ССl4 або ХДХК.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Результати дослідження мають фундаментальне значення для з'ясування механізмів регуляції апоптотичної та некротичної загибелі клітин, зокрема гепатоцитів, в нормі та при патології. Їх практичне значення полягає в обгрунтуванні необхідності диференційованного вивчення апоптотичної і некротичної загибелі клітин при захворюванні печінки різної етіології, а також в обгрунтуванні можливості корекції цих процесів за допомогою впливу на синтез тромбоксану.

Особистий внесок здобувача. При виконанні роботи здобувачем проведено науковий пошук і обгрунтування вибраного напрямку досліджень. Виконані експерименти по вивченню впливу екзогенних ТхВ2, ПГЕ2, ПГF2a та блокаторів їх синтезу на загибель інтактних і ушкодженних гепатоцитів. Досліджено вплив циклоспорину А на загибель клітин; вивчено зміни активності каспаз у культуральному середовищі гепатоцитів. Проведено статистичну обробку і аналіз одержаних результатів, підготовлено до публікації матеріали стосовно основних положень експериментальних досліджень. Експериментальна робота по одержанню і культивуванню гепатоцитів проведена спільно з співробітниками відділу іммунології та цитотоксичних сироваток Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися на Пленумі наукового товариства патофізіологів України (Одеса, 19-21 вересня 2002р.); на конференції молодих учених Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАНУ (Київ, листопад 2003р); на конференції студентів та молодих вчених по молекулярній біології та генетиці з міжнародною участю, (Інститут молекулярної біології та генетики, Київ, 25-27 вересня, 2003р); на 17 з'їзді фізіологів України (Чернівці, 18-20 травня 2006р).

Публікації. Результати дисертації викладені в 16 публікаціях: статті - 6, тези конференцій, симпозіумів, з'їздів, пленумів - 10.

Структура та обсяг дисертації: Дисертація викладена на 135 сторінках друкованого тексту та ілюстрована 15 рисунками і 14 таблицями. Робота складається зі вступу, огляду літератури, розділу опису матеріалів і методів дослідження, 5 розділів результатів власних досліджень, розділу аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаної літератури, що нараховує 164 найменування.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження.

Одержаннякультури гепатоцитів щурів. Для отримання клітин печінки були використані статевозрілі самці щурів лінії Вістар масою 170-180 г, що утримувалися на стандартному раціоні віварію. При роботі з тваринами дотримувались Міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин.

Виділення гепатоцитів проводили в стерильних умовах за методом Сеглена з деякими модифікаціями [Ruan Z. et al, 2004]. Тварин наркотизували нембуталом (40 мг/кг, внутрішньоочеревинно) та вводили гепарин (100 од.) в хвостову вену. Далі здійснювали двохетапну перфузію печінки через нижню полу вену спочатку безкальцієвим розчином Хенкса (7-10 хв.), що містив 9 ммоль/л HEPES і 0,5 ммоль/л EГTA, після чого продовжували перфузію 0,05 % розчином колагенази (Sigma, тип 1А) в розчині Хенкса з 9 ммоль/л HEPES і 5 ммоль/л CaCl2 (рН 7,4; 37оС) протягом 25-30 хвилин. Капсулу печінки розривали, отриману суспензію клітин фільтрували та паренхіматозні клітини осаджували двічі протягом 30 сек при 280 g. Додатково гепатоцити очищали центрифугуванням в дискретному градієнті густини Перколу (Sigma, USA) протягом 30 хвилин при 750 g (20оС). Очищені гепатоцити збирали на межі розділу між 73 % і 57 % розчином Перколу.

Культивування гепатоцитів проводили в середовищі культивування (RPMI 1640 (Sigma) з 15 ммоль/л HEPES та 10% ембріональної телячої сироватки та антибіотиків) в 24-лункових планшетах для культур клітин ("Sigma", США) на покритому колагеном склі, або в 6-лункових планшетах, дно яких покривали полі-L-лізіном, в залежності від схеми експерименту. Гепатоцити вносили в кількості 1,5105 клітин на лунку 24-лункового планшета в 0,6 мл середовища культивування, або в кількості 2106 клітин на лунку 6-лункового планшета в 2 мл культурального середовища. Через 3 години після посадки культури відмивали від неприкріплених клітин. Після 18-годинного культивування моношар гепатоцитів відмивали, вносили середовище інкубації та здійснювали відповідні для різних серій експериментів впливи.

1 серія –екзогенний ТхВ2 ("Sigma", США), вносили в культури двічі з інтервалом 1 годину в кінцевих концентраціях – 0,001, 0,01, 0,1 і 1 мкмоль/л.

2 серія - СС14 (попередньо розчинений в диметилсульфоксиді –ДМСО), вносили в культури в кінцевій концентрації 10 ммоль/л. Екзогенний ТхВ2 (0,1 мкмоль/л) і екзогенні ПГЕ2 та F2a (Pharmacia, Бельгія) (3 мкмоль/л) вносили двічі, за 30 хвилин до ушкоджуючого впливу СС14 і через 30 хвилин після нього.

3 серія - ХДХК вносили в культури в кінцевій концентрації 100мкмоль/л; екзогенний ТхВ2 (0,1 мкмоль/л) і екзогенні ПГЕ2 та F2a (Pharmacia, Бельгія) (3 мкмоль/л) вносили двічі, за 30 хвилин до ушкоджуючого впливу ХДХК і через 30 хвилин після нього.

4 серія – в культуральне середовище вносили блокатори: загальний блокатор циклооксигенази - ацетилсаліцилову кислоту (АСК) в кінцевій концентрації 200 мкмоль/л і блокатор тромбоксансинтетази - бензилімідазол (БІА) в кінцевій концентрації 20 мкмоль/л. Через 15 хвилин додавали СС14 (10 ммоль/л) або ХДХК (100мкмоль/л).

5 серія - в культуральне середовище вносили блокатор утворення мітохондріальних пор циклоспорин А в кінцевій концентрації 1 мкмоль/л, через 15 хвилин після впливу - Тх В2 в кінцевій концентрації 0,1 мкмоль/л.

Контролем для кожної концентрації ТхВ2 слугували культури, оброблені етанолом в концентрації, що дорівнювала такій в відповідному розчині ТхВ2.

Оцінка апоптозу та некрозу гепатоцитів за методом прижиттєвого подвійного забарвлення флуоресцентними барвниками. Культури клітин прижиттєво забарвлювали розчином барвників Хехст 33342 ("Sigma", США) та пропідіума йодид ("Sigma", США) [Shimizu S. et al., 1996]. Йодид пропідіума проникає тільки у клітини з ушкодженими мембранами і забарвлює їх ядра в оранжевий колір. Барвник Хехст 33342 проникає і через неушкоджені мембрани і забарвлює ядра живих клітин і клітин, що гинуть за апоптотичним шляхом, у зелено-синій колір. Зв'язані з хроматином барвники дають змогу оцінити морфологічні риси ядерного матеріалу, притаманні апоптозу: периферичне розташування хроматину, його конденсацію, фрагментацію ядер, а також розпад гепатоцитів на апоптотичні тільця.

Підрахунок живих, некротичних та апоптотичних клітин здійснювали за допомогою люмінесцентного мікроскопа (МЛ-2) з водно-імерсійним об'єктивом х70 та окуляром х 5. В кожному експерименті оцінювали стан не менш ніж 600 клітин. У випадку неоднорідної популяції, як при ушкодженні СС14, підраховували в кожній культурі 800-1200 клітин на межі зони ушкодження.

Електронно-мікроскопічні дослідження апоптотичної та некротичної загибелі гепатоцитів.

Гепатоцити культивували за вищеописаною схемою в обробленних колагеном 8-ми лункових планшетах для електронної мікроскопії з відривним дном ("Lab-Tek") в 0,6 мл культурального середовища. Препарати готували за загальноприйнятою методикою.

Визначення активності каспаз.

Активність каспаз в клітинному лізаті вивчали колориметричним методом (Сaspase-3/CPP32 Colorimetric Assay Kit, FLICE/Сaspase-8 Colorimetric Protease Assay Kits) за інструкцією фірми-виробника набору (BioVision Research Products, USA). Метод базується на спектрофотометричному визначенні кількості хромофора р-нітроаніліда (pNA), після його відщеплення від міченого субстрата (для каспази-3 - DEVD-pNA і для каспази 8 - IETD- pNA).

Loading...

 
 

Цікаве