WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Структурно-функціональні властивості гемаглютиніну і нейрамінідази різних штамів віруса грипу Н9N2 (автореферат) - Реферат

Структурно-функціональні властивості гемаглютиніну і нейрамінідази різних штамів віруса грипу Н9N2 (автореферат) - Реферат

Продукти реакції розділяли методом електрофорезу в агарозному гелі, вирізали відповідні ділянки, очищали за допомогою набору фірми QIAGEN, Valencia, Calif. і секвенували .

Відтворення амінокислотних послідовностей за відповідними їм нуклеотидними та статистичний аналіз результатів проводили за допомогою комп'ютерної програми Bio Edit Package, Version 5 [www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.,1997]. Еволюційні дерева будували за програмою PHYLIP (Phylogeny Inference Package, Version 3,6) [www. evolution. genetics. washington. edu/ phylip., 2000]. В цих розрахунках використовували також взяті з генного банку послідовності NА і HА 23 вірусів грипу птахів, ссавців, в тому числі людини, які були вилучені в період 1979 – 1999 років.

Статистичну обробку даних біохімічних досліджень проводили використовуючи критерій Стьюдента та непараметричний критерій Вілкоксона-Манна-Уітні [Иванов Ю. И., Погорелюк О. Н., 1990].

Результати досліджень та їх обговорення

Еволюція структурно-функціональних властивостей НА.Про функціональні властивості HА можна судити за швидкістю та ступенем адсорбції вірусу на клітинах – мішенях. На рис. 1 зображені часові залежності ступеню зв'язування 6 штамів вірусу грипу H9N2 (включаючи референтний штам ty/wisconsin-66) на культурі клітин собаки МDCK та курячих эритроцитах, а в табл.1 наведені розраховані згідно з цими кривими константи швидкості, часи адсорбції 50% вірусу на різних клітинах та константи зв'язування його з різними клітинами.

Як видно, для всіх досліджених штамів швидкість і ступінь адсорбції вірусів на курячих еритроцитах набагато вищі, ніж на клітинах MCDK. На 16-у хвилину віруси всіх штамів повністю пов'язуються з першими, в той час як на других ступінь адсорбції навіть за 90 хвилин не досягає 100%.

Але в обох випадках характер адсорбції референтного та інших вивчених штамів суттєво розрізняються. Швидкість та ступінь адсорбції референтного віруса на клітинах курки вищі, а на клітинах собаки – нижчі, ніж всіх інших вірусів. Це свідчить про те, що в процесі еволюції вірусу Н9N2 в період з 1966 по 2004 р. його спорідненість до клітин птахів зменшилась, а до клітин ссавців – зросла.

В той же час, як видно, ці зміни спорідненості в період 2000 – 2004 р.р. за своїм характером не є регулярними. Так, у штама, що був ізольований в травні 2000 р, адсорбція на клітинах собаки більш інтенсивна, ніж у штамів, ізольованих в січні та травні 2004 р. Значення констант адсорбції на цих клітинах у штама, ізольованого в січні 2003 р., вірогідно нижча, ніж у штама, ізольованого в липні цього ж року і т.ін. (Табл. 1). Це свідчить, що єдиний процес – наближення спорідненості пташиного віруса H9N2 до рецепторів клітин ссавців здійснюється звичайним шляхом – в результаті диференційної еволюції мутантних форм, що виникають безперервно.

Цілком природно, що в основі цього процесу лежать мутації в генах HА, які змінюють його первинну структуру, та, відповідно, функціональні властивості.

Приєднання вірусу грипу до клітини можливе тільки після активації HА шляхом розщеплення його молекули тканинними протеазами хазяїна в сайті розщеплення – між 326 і 330 амінокислотними залишками, і взаємодією клітинного рецептора з рецептор-зв'язуваючою ділянкою HА – поміж амінокислотними залишками у позиціях 98 – 228.

Різна кінетика адсорбції, що знайдена у досліджених штамів, може вказувати на те, що в процесі еволюції вірусу виникли структурні відмінності – або в сайтах розщеплення, або в рецептор-зв'язуваючих сайтах, або в тих та інших

Для підтвердження існування таких замін і з'ясування їх характеру для всіх штамів, ізольованих на протязі епізоотії 2000 – 2004 р.р., а також референтного штаму вірусу птахів, на основі вивчення відповідних нуклеотидних послідовностей порівнювали поміж собою первинну структуру обох ділянок.

Таблиця 1

Константи швидкості (К), часи 50% – ної адсорбції (t50%) та константи зв'язування (Кб)

штамів вірусу пташиного грипу H9N2 на клітинахМDCK та курячих еритроцитах

Штам вірусу,

датаізоляції

Клітини MDCK

Еритроцити курки

К, % /хв.

t50%, хв.

Кб

К, %/хв

t50%, хв.

Кб

ty/wisconsin-66, 1966

1,33+

0,15

43,5+

3,8

0,024

0,006

39,57+

4,22

1,2+

0,08

2,70

0,33

ty/90710/, 30.05.2000

3,68*+

0,32

15,0*+

1,7

0,090*

0,010

26,31*+

1,98

1,8+

0,20

1,18*

0,21

ty/615/, 30.01.2002

2,02*+

0,18

35,5*+

2,9

0,037

0,008

30,82+

3,12

2,2*+

0,24

0,48*

0,05

ty/965/, 17.03.2002

2,02*+

0,22

35,5*+

3,2

0,037

0,007

21,18*+

2,32

2,4*+

0,22

0,55*

0,06

сh/1373/, 14.07.2003

4,12*+

0,46

11,5*+

0,9

0,530*

0,060

21,18*+

1,95

2,8*+

0,21

0,15*

0,02

ty/1562/, 28.12.2003

2,97*+

0,25

17,0*+

1,5

0,060*

0,009

21,18*+

2,23

2,8*+

0,19

0,15*

0,02

ty/1747/, 15.05.2004

2,97*+

0,25

17,0*+

1,6

0,060*

0,009

21,18*+

1,95

2,8*+

0,30

0,15*

0,02

Примітка* – вірогідно відносно референтного штаму (р < 0,05).

В кожній з них на протязі епізоотії відбулося по дві амінокислотні заміни – в рецептор-зв'язуваючому сайті в позиціях 190 і 226, а в сайті розщеплення – в позиціях 326 і 329.

В таблиці 2, згідно з хронологичним порядком, наведені амінокислотні заміни, що були знайдені.

Як бачимо, хоча в рецептор-зв'язуваючому сайті частоти зустрічальності Ала в позиції 190 і Лей в позиції 226 вищі частот зустрічальності Глу і Глн в цих позиціях, обидві заміни досить рівномірно розсіяні по дослідженим штамам вірусу і не мають регулярного характеру на протязі епізоотії.

В сайті розщеплення, навпаки, заміни амінокіслот в позиціях 327 і 329 мають відверто регулярний, спрямований характер (Табл. 3).

Для з'ясування зв'язку між цими замінами і функціональними властивостями HА проведено співставлення первинних структур сайтів розщеплення та відповідних усереднених показників кінетики адсорбції.

Таблиця 2

Амінокислотні залишки в позиціях 190 і 226 рецептор-зв'язуючого сайту HA штамів вірусу пташиного грипу H9N2

Позиція

Амінокис-лотний залишок

Число

штамів

%

штамів

Дата ізоляції

190

Глу

18

30

30.05.2000р., 20.01.2002 р., 30.01.2002р., 10.02.2002р., 14.02.2002р, 05.03.2002 –19.04.2002 р., 22.12.2002 – 21.01.2003 р., 02.04.2003 р., 30.10.2003 р., 09.01.2004 р. –

190

Ала

43

70

23.05.2000 р. –25.12.2001 р., 30.01.2002 р., 03.02.2002 р., 17.02.2002 р., 11.12.2002 р.,

24.02.2003 р., 02.04.2003 р., 06.04.2003 р. – 14.07.2003р., 21.11.2003р. – 06.01.2004 р.,

13.01.2004 р. – 15.05. 2004 р.

226

Глн

23

38

30.05.2000р., 20.01.2002р., 14.02.2002р,

05.03.2002 – 19.04.2002р., 22.12.2002 –

24.02.2003 р., 02.04.2003 р., 06.04.2003 р.,

13.04.2003 р., 10.07.2003 р., 22.12.2003 р.,

28.12.2003 р., 09.01.2004 р., 15.05.2004 р.

226

Лей

38

62

23.05.2000 р. -25.12.2001 р., 30.01.2002 р. –

10.02.2002 р., 17.02.2002 р., 11.12.2002 р.,

02.04.2003 р., 06.04.2003 р., 20.04.2003 р.-

26.05.2003 р., 14.07.2003 р. – 08.12.2003 р.,

24.12.2003 р., 28.12.2003 р.. 31.12.2003 р. –

06.01.2004 р., 13.01.2004 р., 14.01.2004 р.,

15.05.2004 р.

Loading...

 
 

Цікаве