WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Структурно-функціональні властивості гемаглютиніну і нейрамінідази різних штамів віруса грипу Н9N2 (автореферат) - Реферат

Структурно-функціональні властивості гемаглютиніну і нейрамінідази різних штамів віруса грипу Н9N2 (автореферат) - Реферат

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше визначені первинні структури ділянок генів HА і NА та відповідні їм амінокислотні послідовності, що обумовлюють функціональні властивості цих білків, які були вилучені з 61 штаму вірусу грипу птахів H9N2 на протязі епідемічного спалаху цієї хвороби в 2000 – 2004 р.р. На підставі отриманих даних проведено систематичне дослідження молекулярних механізмів еволюції вірусу H9N2 за 4-річний період.

Показано, щоеволюція вірусу грипу в ході епізоотії йшла не шляхом поступових змін від первісного варіанту до кінцевого, а шляхом появи ряда форм, що відрізняються як одна від одної, так і від початкового варіанту.

Вперше показано зв'язок між конкретними мутаціями в нуклеотидному складі генів HА і NА, відповідними амінокислотними змінами та функціональною активністю цих білків – швидкістю та ступенем адсорбції вірусу на клітинах і температурним оптимумом дії NА.

Отримані дані вперше демонструють структурно-функціональні властивості молекул HА та NА, що відіграють вирішальну роль у взаємодії збудника хвороби та хазяїна і дозволяють вірусу грипу птахів H9N2 переходити в резервуар ссавців.

Вперше описано варіанти вірусу H9N2, які є найбільш відповідними кандидатами для переходу на ссавців, в тому числі і на людей.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів. З теоретичної точки зору, отримані результати доповнюють сучасні уявлення про молекулярні засади еволюції вірусів грипу та є важливими для розуміння процесів, що дозволяють вірусам переходити від птахів до ссавців. Зокрема, вони розкривають зв'язок між мутаційними змінами в генах та структурно-функціональними властивостями білків, відповідальних за взаємодію віруса з клітинами хазяїв, що належать до різних систематичних груп організмів. Отримані дані дозволяють також розробити молекулярні критерії можливості різних варіантів вірусу пташиного грипу переходити на ссавців та людей.

Практичне значення результатів дисертаційної роботи полягає насамперед в тому, що вони можуть бути корисними для передбачення появи нових штамів вірусу грипу з підвищеною здібністю інфікувати організм людини. Дані про еволюційні зміни первинної структури та антигенні властивості поверхневих білків вірусу можуть бути використані для планування і прискорення створення нових вакцин, а саме, для рекомендації вибору нових вірусних штамів, що можуть забезпечити максимальну захисну реакцію організму тварин та людини від грипу. Отримані результати використовуються в навчальному процесі під час викладання спецкурсів "Фізіологічні і біохімічні основи адаптації", "Молекулярні основи імунології" та "Молекулярні механізми еволюції" на біологічному факультеті Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна.

Особистий внесок здобувача. Відповідно до поставлених мети та задач роботи, автором самостійно виконано запланований обсяг експериментальних досліджень, розрахунки еволюційних відношень досліджених штамів вірусу грипу, аналіз наукової літератури, зроблена статистична обробка фактичного матеріалу.

Планування напрямків досліджень та інтерпретацію отриманих результатів проведено сумісно з науковим керівником. Ізоляцію вірусів та оцінку їхньої патогенності було проведено сумісно зі співробітниками Ветеринарного інституту Кимрона (Бейт-Даган, Ізраїль), що відображено в спільних публікаціях. В дисертації не використані ідеї чи розробки, які належали б співавторам опублікованих наукових праць.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались та обговорювались на ХIII Конгресі всесвітньої ветеринарної асоціації домашніх птахів (Денвер, Колорадо, 2003 р.); щорічному з'їзді Ізраїльського товариства мікробіологів (Тель-Авів, 2003 р.); ХІІ Міжнародному конгресі імунологів і ІV щорічній Конференції імунологів (FOCIS) (Монреаль, Канада, 2004 р.); науковій Конференції, присвяченій 70-річчю кафедри генетики і цитології Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна (Харків, 2004 р.); V Інтернаціональному симпозіумі по захворюванням птахів (Берлін, Німеччина, 2004 р.); IX Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових праць, серед яких 6 статей у журналах та 8 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 4-х розділів результатів дослідження та їх обговорення, заключення, висновків та списку літератури (з 194 джерел). Робота викладена на 144 сторінках друкованого тексту і містить 18 малюнків та 26 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Дослідження проведені на 61 штамі вірусу грипу H9N2, що були виділені у птахівничих господарствах Ізраіля в період епізоотії 2000 – 2004 р.р. Референтні штами пташиного {ty/wisconsin-66 – (H9N2)} та людських {Singapore/57 – (H2N2) і Hong Kong/68 (H3N2)} вірусів грипу були люб'язно надані доктором Скехелом [Dr. Skehel, World Influenza Center, National Institute for Mеdical Reserch, Mill Hill, London].

Для ізоляції вірусів 9–10-денні ембріони курей інфікували шляхом введення культури віруса (1 мл трахеальних та клоакальних змивів в гліцерофосфатному буфері, рН 7,2) в алантоїсну порожнину. Через 48–96 годин після зараження алантоїсну рідину відбирали, аліквотували, перевіряли на присутність антигену, заморожували та зберігали при – 800 С.

Патогенність вірусів оцінювали за індексом смертності (IVPI) курчат віком 6 тижнів після внутрішньовенного введення вірусу методом, рекомендованимОІЕ [Office International des Epizootiеs, 2000].

Функціональні властивості HА та NА вивчали у вірусів, що були отримані на початку, в середині та в кінці епізоотії і порівнювали їх з властивостями цих білків у референтних вірусів.

Антигенні властивості HА визначали за допомогою реакції гальмування гемаглютинації (РГГА). Визначення проводили в 1% суспензії курячих еритроцитів, що містила 4 аглютинаційні одиниці (АО) антигену, за допомогою набору референтних антисироваток до 15-ти серотипів HА (Н1 – Н15) и 9-ти серотипів NА (NA1 – NA9) за методом, який рекомендовано ВООЗ [Douwdal W.A. et al., 1979]. Антисироватки були надані доктором Вебстером [Dr. Webster, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, USA].

Про рецепторні властивості HА робили висновки згідно з реакцією гемаглютинації, яку проводили в двох варіантах – на моношаровій культурі клітин нирок собаки (МDCK) та на еритроцитах курей.

Клітини МDCK отримували з клітинного банку АТСС (American Type Culture Collection) і культивували в середовищі МЕМ (Minimum Essential Medium) з 10% ембріональною сироваткою теляти. В разі еритроцитів використовували їхню 15% суспензію та алантоїсну рідину з титром не менш, ніж 1:128 [Rivetz R., Lipkind M., 1985].ступінь адсорбції вірусу оцінювали за зміною титру гемаглютинації в пробах, які відбирали з інтервалами 15 хвилин для клітин МDCK та 2 хвилини -для курячих еритроцитів при 40С.

Розраховували час адсорбції 50% вірусу на клітинах ( t50% ) , константу ії швидкості (К – тангенс початкового кута нахилу кінетичної кривої адсорбції) та за методом Скетчарда [Dupuis G., Clairoux-Moreau S., 1980] – константу зв'язування (Кб=[Сv · Cc] /[Сv] · [Cc], де [Сv · Cc] – питомий вміст комплексів клітина-вірус, Сv і Cc – питомий вміст вільних вірусу та клітин відповідно).

Ферментативну активність NА при 150, 250, 370, 420 і 560С оцінювали за ступенем гідролізу нею субстрата – фетуїна та виражали в одиницях оптичної густини при λ = 549 нм [ Palmer D.F. et al, 1975]. На підставі отриманих даних розраховували константу Міхаеліса Km

Реакцію гальмування активності NА (РГNА) проводили за методом, рекомендованим ОІЕ, в рівних об'ємах вірусовмісних рідин – алантоїсній рідині та антинейрамінідазній антисироватці.

Вірусну РНК виділяли з алантоїсної рідини за допомогою набору mini kit Viral RNA фірми QIAGEN, Valencia, Calif. і використовували для клонування ДНК в ПЛР. В реакціях ПЛР для ділянок нуклеотидних послідовностей, що дозволяють ідентифікувати підтипи HА та NА вірусів грипу, було використано 2 набори праймерів: 15 пар (Н1f – Н15f, Н1r – Н15r) для HА и 9 пар (1Nf – 9Nf, 1Nr – 9Nr) для NА [Lee M.-S. et al, 2001]. Праймери були сконструйовані в лабораторії молекулярної вірусології (Kimron Veterenary Institute, Beit Dagan, Israel).

Loading...

 
 

Цікаве