WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки (автореферат) - Реферат

Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки (автореферат) - Реферат

Підсумовуючи результати розділу можна заключити, що використовуючи методи фіксації мембранного потенціалу в конфігурації whole-cell та полярографічний метод для вимірювання парціального тиску кисню (pO2) ми встановили, що зменшення pO2до 1530 mmHg індукувало потенціацію HVA Ca2+ струму на 94%. Використання селективних блокаторів N- і L-типів Ca2+ каналів, показало, що блокування Ca2+ каналів L-типу зменшувало гіпоксичний ефект на 54%, тоді як блокатор N-типу зменшував ефект на 30%. Враховуючи співвідношення струмів, що створюються підтипами Ca2+ каналів в CA1 гіпокампальних нейронах, ми заключили, що обидва типи HVA Ca2+ каналів чутливі до гіпоксії, проте L-тип був в 3.5 разів більш чутливим до зниження рівню кисню (Рис.22).

УЧАСТЬ CA2+ КАНАЛІВ В РОЗВИТКУ ЕПІЛЕПСІЇ

Леветірацетам (LEV) є новим антиепілептичним препаратом (AED) з унікальним фармакологічним профілем, яке спричиняє потужне пригнічення нападів, викликаних в кідлінг моделях епілепсії (Loscher et al., 1998; Klitgaard et al., 1998). Ця сполука суттєво пригнічує нейрональну гіперсинхронність в гіпокампі, індуковану додаванням розчину, що містить високий рівень калію та низький рівень кальцію, без будь-яких суттєвих ефектів на нормальні електрофізіологічні відповіді нейронів (Margineanu & Klitgaard, 2000). Таким чином, представлялось дуже важливим, оцінити можливі клітинні механізми антиепілептичної дії сполуки LEV, які можуть бути пов'язані з його специфічною взаємодією з молекулярними структурами, відповідальними за генерацію електричної активності нейронів мозку.

Попередні дослідження не показали будь-яку модуляторну активність леветірацетаму на потенціал-залежні Na+ та низькопорогові Ca2+ струми у щурячих неокортикальних нейронах (Niespodziany et al., 2000a; Zona et al., 2001). Тому, в даних дослідженнях особлива увага була приділена високопороговим Ca2+ струмам, які також можуть відповідати за зміни характерів генерації потенціалів дії у відповідних нейронах. Особливий інтерес викликало можливість, оцінити здатність LEV специфічно взаємодіяти з різними підтипами цих каналів, експресованих в різних типах нервових клітин. В представлених у цьому розділі експериментах, ми проаналізували результат дії LEV на HVA Ca2+ в ізольованих нейронах CA1 зони гіпокампа щура, розділених на головні підтипи каналів (L, N, P, Q і R) шляхом застосування стандартних селективних канальних блокаторів.

Підсумовуючи результати можна констатувати, що ефект нового антиепілептичного препарату левотерацитаму (LEV) на різні типи високопорогових Ca2+ каналів (HVA) був досліджений на ізольованих нейронах гіпокампу щурів. Блокатори Ca2+ каналу використовувалися для виділення підтипів Ca2+ каналів. Струми були заміряні в контролі і після аплікації 1-200 М LEV. Ми встановили, що LEV не зворотно пригнічував HVA кальцієвий струм в середньому на 18% (Рис.23). Визначена концентрація половинного пригнічення Ca2+ струму (IC50) блокатором становила 14.7 М (Рис.24), що відповідає концентраціям при клінічних застосуваннях. Використовуючи преімпульсний протокол стимулювання, ми показали, що G-білки не були залучені в шляхи що лежать в основі ефекту LEV, припускаючи, що ефект полягає в прямій дії LEV на молекулу каналу. Механізм блокування LEV не був пов'язаний з стаціонарною активацією або інактивацією Ca2+ каналів. LEV не впливав на спад HVA Ca2+ протягом експериментальних протоколів, що продовжувалися близько 10 min. Нарешті, LEV при найвищій концентрації, що використовувалися (200 M) не впливав на активність Ca2+ каналів L-, P- або Q-типу в СА1 нейронах щурів гіпокампа, тоді як він селективно впливав на активність Ca2+ каналів N-типу із гіпокампу. Максимальний ефект на ці канали, фармакологічно відокремлені від інших, був близько 37% (Рис.25). Отримані результати підтверджують факт, що LEV селективно пригнічує N-тип Ca2+ каналів СА1 пірамідальних нейронів гіпокампу. Ці дані також дозволяють припустити існування підтипу N-типу кальцієвих каналів, чутливих до LEV, які можуть бути залучені в молекулярну основу його антиепілептичноі дії.

ВИСНОВКИ

  1. У дисертаційній роботі наведені дослідження потенціалокерованих Ca2+ каналів, пов'язані з регуляцією, функцією та роллю в патологічних станах нервової системи, які вивчалися за допомогою ряду електрофізіологічних, мікрофлуоресцентних, імуноцитохімічних, молекулярнобіологічних та інших методів.

  2. За допомогою реєстрації активності поодиноких Ca2+ каналів встановлено, що РК-А-залежне фосфорилування Ca2+ каналів, котре викликає збільшення Ca2+ макроструму, змінює кінетику поодиноких каналів, збільшує число активних каналів і вірогідність їх знаходження у відкритому стані. В той же час фосфорилування не впливає на провідність поодинокого каналу .

  3. За допомогою імуноцитохімічних досліджень, встановлено, що Ca2+-залежна фосфатаза кальцинейрин у великій кількості експресується в DRG нейронах, де він локалізований переважно біля внутрішньої поверхні плазматичної мембрани і його локалізація співпадає з локалізацією -субодиниці Ca2+ каналів. Це може свідчити про те, що функція кальцинейрину мабуть безпосередньо пов'язана з активністю потенціалокерованих Ca2+ каналів.

  4. Досліджено взаємодію між кальцинейрином (PP2B) і Ca2+ каналами в NG108-15 клітинах, які оверекспресують PP2B, і встановили, що в таких клітинах сумарні високопорогові Ca2+ струми пригнічуються майже на 60% по відношенню до контролю. Внутрішньоклітинне додавання блокаторів кальцинейрину індукувало 5-ти разове збільшення амплітуди цих Ca2+ каналів, що свідчить, що активність PP2B не впливає на експресію каналів, але модулює їх функцію Ca2+-залежним дефосфорилуванням каналів, котрі знаходяться в фосфорильованому стані, і що РР2В, головним чином, впливає на активність N-типу Ca2+ каналів в NG108-15 клітинах.

  5. Досліджено роль різних типів Ca2+ каналів у секреції (екзоцитозі) катехоламінів в хромафінних клітинах і встановлено, що секреція, виміряна змінами ємності мембрани, переважно визначається загальним кумулятивним зарядом Ca2+ струму і базальним рівнем [Ca2+]i, котрий передує стимулу і не залежить від типу Ca2+ каналів.

  6. Встановдено, що викликаний деполяризацією екзоцитоз проходить через два ступені, обидва з яких лінійно залежать від [Ca2+]i і від порогової "критичної" концентрації Ca2+ (200  300 nM). Запропоновано везикулярний механізм, що описує двоступеневу залежність екзоцитозу від внутрішньоклітинного Ca2+ ([Ca2+]i). Згідно моделі, при рівні [Ca2+]i, нижчому порогової точки, везикули малого розміру зливаються з плазматичною мембраною, тоді як при вищому, починають зливатися з мембраною і везикули більшого розміру.

  7. Зроблено морфологічний аналіз та досліджено склад везикул в хромафінних клітинах. Встановлено, що в цих клітинах існує велика кількість везикул, які відрізняються за своєю морфологією та функцією. Показано, що при деполяризації хромафінних клітин деполяризацією, підвищенням внутрішнього Ca2+ або агоністом ацетилхолінових рецепторів у секреції приймають участь два типи везикул, малі або середні електронно-щільні та синаптично-подібні світлі, які залучені у процес екзоцитозу різними механізмами – темні везикули шляхом повного злиття з мембраною, тоді як світлі – через формування ніжки та тимчасового злиття.

  8. За допомогою флуоресцентного методу з використанням зонду Fura-2 показано, що зменшення парціального тиску кисню до 2535 мм рт.ст. у зовнішньоклітинному середовищі ізольованих сенсорних нейронів щурів спричиняє збільшення внутрішньоклітинної концентрації вільних іонів кальцію на 120 % і основним шляхом цього збільшення є потенціалокеровані кальцієві канали L-типу в DRG нейронах.

  9. Досліджено роль Ca2+ каналів в перебігу гіпоксичного ефекту в нейронах гіпокампу. Встановлено, що помірна гіпоксія (20-30 mm Hg) спричиняє подвійну дію на Ca2+ канали – з одного боку, вона викликає внутрішньоклітинно опосередкований приріст кальцієвого входу через Ca2+ канали, і з другого боку - їх Ca2+ -залежну інактивацію.

  10. Встановлено, що зниження pO2до 1530 mm Hg індукує потенціацію HVA Ca2+ струму на 94% в нейронах гіпокампу. Використання селективних блокаторів Ca2+ каналів показало, що блокування каналів L-типу зменшує гіпоксичний ефект на 54%, тоді як блокатор N-типу на 30%. Враховуючи співвідношення струмів, що створюються підтипами Ca2+ каналів в цих клітинах, знайдено, що обидва типи HVA Ca2+ каналів чутливі до гіпоксії, проте L-тип майже в 3.5 разів більш чутливий до зниження рівню кисню.

  11. Вперше встановлено, що антиепілептична сполука леветірацетам селективно блокує N-тип Ca2+ каналів в нейронах гіпокампу, що може лежати в основі її анти-епілептичної дії.

  12. Зроблено висновок щодо ролі і принципів регуляції активності Ca2+ каналів, як однієї з основних функцій нейронів і ендокринних клітин, а також основних причин патологічних станів мозку (ішемії/гіпоксії та епілепсії), а також особливостей фармакологічного впливу на такого роду зміни, що складає основу для вивчення можливостей корекції ряду клінічних захворювань.

Loading...

 
 

Цікаве