WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки (автореферат) - Реферат

Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки (автореферат) - Реферат

Підсумовуючи отримані дані можна заключити, що викликаний деполяризацією екзоцитоз проходить через дві ступені, обидві з яких лінійно залежать від [Ca2+]i. При [Ca2+]i , що лежить нижче критичної точки (200  300 nM) нахил взаємовідношення (Cm(Cai)) складав 4.43 і при [Ca2+]i, що перевищує критичну точку нахил був рівний 31.63. Ми запропонували везикулярний механізм, що описує експериментальну двоступеневу залежність екзоцитозу від внутрішньоклітинного Ca2+ ([Ca2+]i). Згідно моделі при рівнях [Ca2+]i нижчим критичної точки, тільки везикули малого розміру зливалися з плазматичною мембраною, тоді як при вищому [Ca2+]i, везикули більшого розміру починають зливатися з мембраною (Рис.16). Цей процес може забезпечити дуже важливий фізіологічний процес - запуск та вивільнення різних нейротрансміторів, які можуть бути диференційовано розподілені серед різних секреторних везикул. Наприклад, класичні нейротрансмітери, розташовані в синаптично-подібних мікровезикулах а пептидні, медіатори можуть бути локалізовані у великих везикулах з щільним вмістом (Рис.17).

УЧАСТЬ КАЛЬЦІЄВИХ КАНАЛІВ В ПАТОЛОГІЧНИХ СТАНАХ

Зміни Ca2+ гомеостазу при гіпоксії

Зниження парціального рівня кисню в позаклітинному середовищі (гіпоксія) є одним з основних ушкоджувальних чинників при мозковій патології, пов'язаній з порушенням мозкового кровооббігу (ішемією). Таке зниження супроводиться комплексом системних процесів, одним з найістотніших з яких являється масоване вивільненняя збудливого синаптичного медіатору (глутамату) і відповідно викликана їм глибока деполяризація нервових клітин, що приводить до практичного виключення їх активності ("эксцитотоксичность"). Механізмам цієї системної реакції присвячена значна кількість експериментальних досліджень. Найістотнішим компонентом її є масований вхід іонів Ca2+ в нейрони через активовані лиганд-керовані канали. Разом з тим, природа безпосередньої дії гіпоксії на нейрон представляється значно менш вивченою, хоча її з'ясування має першорядне значення для розуміння основ ушкоджувальної дії гіпоксії. Мабуть, в самому нейроні є механізми, безпосередньо реагуючі на зниження парціального рівня кисню біля його поверхні, які можна було б позначити як первинні сенсори гіпоксії; їх включення приводить до більш глибоких системних порушень функції клітини і можливо до її загибелі.

Тому нами був проведений докладний розгляд тих первинних змін, які безпосередньо виникають в нейроні при зміні нормоксичного зовнішнього середовища на гіпоксичне (1040 mmHg); для виключення можливих міжклітинних взаємодій дослідження проводилися на ізольованих сенсорних нейронах (DRG нейрони) із заднєкорінцевих гангліїв щурів. Оскільки порушення кальцієвого гомеостазу є найвірогіднішим компонентом таких змін, було використано пряме визначення змін рівня вільних іонів Ca2+ в нейроні за допомогою введення в нього флуоресцентного кальцієвого індикатора Фура-2АМ; рівень pO2 біля зовнішньої поверхні клітини безперервно вимірювався полярографично за допомогою платинового мікроелектроду.

Підсумовуючи отримані результати можна констатувати, що гіпоксія викликала істотне підвищення внутріклітинного рівня Ca2+ вже через декілька секунд після початку її дії (Рис.18). Викликаний гіпоксією ефект майже повністю усувався блокуванням потенціал-керованих кальцієвих каналів L-типу або усуненням іонів Ca2+ з позаклітинного середовища. Отримані дані дозволяють припустити, що початковими сенсорами гіпоксичної дії на досліджені нейрони є потенціалокеровані кальцієві іонні канали плазматичної мембрани, зміни активності яких вторинно викликають порушення функції іонообмінних механізмів плазматичної мембрани. Ці зміни можна розглядати як сигнальні процеси, за якими при тривалій дії гіпоксії слідують більш глибокі зміни клітинних функцій, пов'язані з порушенням енергетичного балансу клітини.

Ефект гіпоксії на Ca2+ канали залежить від внутрішньоклітинного Ca2+

Одна з проблем яка має важливе значення, в цьому контексті є природа гіпоксичних сенсорів в нейронах. Молекулярні принципи таких "сенсорів" залишається в значній мірі невідомою. Вірогідно, що плазматично - іонні канали мембрани можуть відігравати певну роль в O2-регульованих процесах (Mironov & Richter, 2000). Існує думка, що індуковані гіпоксією ефекти в нейронах можуть бути опосередковані переважно відкриттям ATP-регульованих K+ каналів (KATP), як результат зменшення внутрішньоклітинного ATP, обумовленого зниженням pO2 (Dart & Standen, 1995). Як результат, може виникати мембранна деполяризація і вхід кальцію в клітину під час гіпоксії (Haddad & Liu, 2000). Проте, здається малоймовірним, що тільки ці процеси є механізмами, які лежать в основі гіпоксичних ефектів, тому що чутливість до гіпоксії в більшості тканин відбувається в діапазоні що перевищує фізіологічний рівень pO2 без змін енергетичного метаболізму. Таким чином, можна припустити, що інші мембранні механізми можуть бути гіпоксіє-чутливим у збудливих клітинах (Haddad & Jiang, 1997).

В наших дослідженнях, ми показали, що високопорогові Ca2+ канали в гіпокампальних нейронах позбавлені чутливості до помірної та глибокої гіпоксії, в умовах коли внутрішньоклітинний розчин містив 10mM EGTA, що абсорбує вільний Ca2+ і, таким чином, запобігає взаємодії цитоплазматичного Ca2+ з молекулою каналу. Тому, в представленій главі ми шукали відповідь на питання як Ca2+ канал відповідає на вплив гіпоксії при наявності зворотного зв'язку з вільним Ca2+ в цитоплазмі у свіжоізольованих гіпокампальних нейронах СА1.

Підсумовуючи описані в розділі результати можна заключити, що зниження pO2 індукувало потенціацію HVA Ca2+ канальної активності на ~25.7 % при [Ca2+]i =75 nM в порівнянні з безкальцієвим розчином. Збільшення [Ca2+]i до 410 nM злегка збільшувало ефект і значно уповільнювало спад (run-down) Ca2+ струму (Рис.20). З другого боку, гіпоксія збільшувала стаціонарну інактивацію і прискорювала кінетику спаду Ca2+ струму приблизно на 30%. Ми встановили, що залежність величини гіпоксичного ефекту від pO2 не лінійна і гіпоксичний ефект суттєво збільшується про pO2 що лижать нижче значень 40 мм Рт.ст. Ми прийшли до висновку, що помірна гіпоксія спричиняє подвійну дію на Ca2+ канали - на внутрішньоклітинно опосередкований приріст кальцієвого входу через Ca2+ канали і їх Ca2+-залежну інактивацію.

Ефект гіпоксії на Ca2+ канали залежить від зовнішньоклітинного Ca2+

Таким чином, ми встановили, що гіпоксія індукує збільшення активності HVA Ca2+ каналів, і цей ефект істотно залежить від концентрації внутрішньоклітинного Ca2+. В експериментах, описаних в цьому розділі, ми тестували роль концентрації зовнішньоклітинного Ca2+ ([Ca2+]e ) у відповідях CA1 нейронів гіпокампу на гіпоксичний вплив. Підсумовуючи дані отримані в цьому розділі щоб з'ясувати, чи гіпоксична чутливість обмежується специфічністю до іонів Ca2+ ми використали петч-клемп вимірювання в конфігурації whole-cell на ізольованих нейронах CA1 гіпокампу щурів. Також використовувався полярографічний метод для парціального вимірюваня тиску O2.. Ми встановили, що в 2mM [Ca2+]e гіпоксичний ефект в 2mM розчині складав ~94% (Рис.19), тоді як підвищення [Ca2+]e до 5 mM і 15 mM привело до поступового зменшення ефекту. Ми встановили, що повний заряд Ca2+, що переноситься в клітину під час гіпоксії, був подібний для всіх тестуємих [Ca2+]e, тоді як заряд Ca2+, що переносився при нормоксії, відрізнявся для різних [Ca2+]e, будучи більшим при вищому [Ca2+]e. Ці дані вказали на насичення гіпоксичного ефекту внаслідок обмеженню провідності каналу (Рис.21). Таким чином, ми припустили, що гіпоксичний ефект міг бути пов"язаний із зростанням провідності каналу, причому рівень провідності каналу при нормоксії може визначити амплітуду гіпоксичного ефекту (Рис.21).

Дія гіпоксії на різні типи Ca2+ каналів

В наших попередніх дослідженнях, ми показали, що HVA Ca2+ струми CA1 гіпокампальних нейронах були чутливі до гіпоксії в певних експериментальних умовах (Shkryl et al., 2001c). Ми знайшли, що ступінь чутливості Ca2+ каналів до гіпоксії залежить від концентрації Ca2+ в середині клітини та зовні клітини. Проте, в тих експериментах ми тестували чутливість загального HVA Ca2+ струму до гіпоксії без розділення струму на його специфічні компоненти. В цьому розділі ми дослідили, як підтипи Ca2+ каналів із ізольованих гіпокампальних CA1 нейронів відповідають на гіпоксичні впливи.

Loading...

 
 

Цікаве