WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки (автореферат) - Реферат

Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки (автореферат) - Реферат

Дані, представлені в цьому розділі пов"язані з вивченням типів секреторних везикул за допомогою електронної мікроскопії.

Підсумовуючи описані дані в цьому розділі можна сказати, що морфометричний аналіз виявив п'ять видів електроннощільних секреторних везикул в хромафінних клітинах. Ними виявилися: елементарні великі катехоламін-вміщуючі хромафінні гранули округлої форми (LDCG), великі щільні везикули овальної і палочковидної форм (LDCVo і LDCVr), малі щільні везикули (SDCV) і рибосомо-вкриті везикули (RCV) проміжної густини. Серед електронно-світлих везикул виявилися малі синаптично-подібні мікровезикули (SLMV), клатрин-вкриті ендоцитотичні везикули (ECCV), везикули конуса росту (GCV) і великі світлі спорожнені везикули (LLCV). Деполяризація мембрани та збільшення внутрішньоклітинного Ca2+ викликали переміщення везикул SLMV, SDCV та LDCVo до мембрани для участі у екзоцитозі. Мікровезикули (SLMV) короткочасно зливалися з мембраною (kiss-and-run механізм, Рис.10) під час індукованого екзоцитозу, тоді як електронно-щільні везикули SDCV та LDCVo малого розміру зливалися із мембраною формуючи омега-подібні вп'ячування (Рис.11). У розділі описана структура і функціональна основа різних типів секреторних везикул концентруючись на їх формуванні і потенційній ролі.

Секреторні відповіді вимірювані амперометричним методом

Наступна серія експериментів була присвячена дослідженню динаміки процесу вивільнення від окремої хромафінної клітини. Для цього застосовувалось два способи ініціації процесу екзоцитозу: активація AСh рецепторів за допомогою аплікації їх агоніста ацетилхоліну (ACh) в концентрації 1 mM та деполяризація клітини розчином, що містив підвищену концентрацію КС1 (50 mM). В останньому випадку відбувалася активація Ca2+ потенціалозалежних каналів.

Представлені в роботі амперометричні експерименти показали, що активація Ca2+ каналів шляхом деполяризації мембрани дійсно спричиняє вивільнення катехоламінів (Рис.12). Порівняння секреторних відповідей викликаних деполяризацією та активацією ACh рецепторів показало, що у випадку короткочасової та довготривалої стимуляції, середня частота появи квантових процесів вивільнення катехоламінів при стимуляціїAChє достовірно вища, ніж у випадку деполяризації клітини підвищеною концентрацією КСl. Порівнюючи загальний рівень процесу секреції ми зробили висновок, що обидва типи стимуляції можуть відігравати суттєву роль в ініціації процесу вивільнення катехоламінів хромафінними клітинами. Причому, у випадку тривалої стимуляції - умови, що може досягатись при різного роду важких патофізіологічних порушеннях, активація ацетилхолінових рецепторів буде відігравати більш суттєву роль в підтриманні відносно постійного рівня екзоцитозу від хромафінних клітин ніж деполяризація мембрани.

Участь Сa2+ каналів в регуляції Сa2+-залежного екзоцитозу

Деталі, що відносяться до механізмів Ca2+-залежного ексоцитозу зараз вивчаються із збільшенним інтересом. Одним з важливих питань - є значення того факту, що окремі підтипи Ca2+ каналів існують в багатьох секреторних клітинах. Давно вже відомо, що збільшення внутрішньоклітинноі концентрації ( [Ca2+]i ) біля плазматичної мембрани завдяки входу Ca2+ через Ca2+ канали мембрани є головним механізмом, що індукує екзоцитоз ((Katz, 1969; Burgoyne, 1995; Neher, 1998) для огляду). Проте існують значні, варіації в думках, щодо того, які типи Ca2+ каналів експресуються в секреторних клітинах, і в якій мірі вони беруть участь у індукції секреції. Також залишається не ясним, чи залучення даного типу Ca2+ каналу в секрецію залежить від специфічного характеру стимулювання, яке використовується.

Як уже вказувалося, внаслідок багатьох схожих властивостей і загального походження з нейронами, хромаффінні клітини дуже інтенсивно використовуються для дослідження фундаментальних механізмів Ca2+-залежного екзоцитозу. Хромафінні клітини секретують катехоламіни і супроводжуючі субстанції (VIP, субстанція P, опіоіди)у відповідь на активність вісцеральних (спланхнічних) нервових закінчень. Декілька типів високо-порогових Ca2+ каналів (N-, L- Q- та P-типи) були ідентифіковані в хромаффінних клітинах за допомогою селективних блокаторів Ca2+ каналів (Albillos et al., 1994; Kitamura et al., 1997), проте значення індивідуального внеску всіх ідентифікованих субтипів каналів в вивільненні катехоламінів залишається суперечливим. Завдяки існуванню такої відмінної інформації щодо ролі субтипів Ca2+ каналів в секреції, ми зробили зусилля, щоб оцінити залучення різних типів Ca2+ каналів у Ca2+-залежний екзоцитоз у хромофінних клітин бика в добре контрольованих умовах.

Підсумовуючи отримані дані можна констатувати, що бичачі хромафінні клітини експресують декілька типів Ca2+ каналів, які завдяки втоку через них Ca2+, запускають екзоцитоз катехоламінів. Використовуючи петч-клемп whole cell вимірювання на ізольованих клітинах культури, в поєднанні з Fura-2 мікрофлуориметрією і фармакологічним маніпулюванням, для того, щоб визначити залежність секреції від різних типів Ca2+ каналів. Ми встановили, що екзоцитоз лінійно залежить величини амплітуди Ca2+ струму (Рис.13), а кількість секреції переважно визначається двома параметрами: Ca2+ зарядом, оціненим як інтеграл Ca2+ струму протягом стимулу і базальним рівнем [Ca2+]i,,який передує даному стимулу (Рис.14). Ми не спостерігали переважаючу роль будь-якого із Ca2+ канальних субтипів, крім того, підвищений базальний рівень [Ca2+]i збільшував секреторну відповідь на Ca2+ струм, що протікав по будь-якому типу Ca2+ каналу. Таким чином, фармакологічне виключення різних типів Ca2+ каналів від участі в секреції не виявило їх специфічні ролі в секреції в наших експериментах, в яких використовувалися відносно довгі імпульси деполяризації (50  200 msec). Ми зробили висновок, що для стимулів довгої тривалості, які вивільняють велику частину готового до вивільнення везикул не так важливо через який тип Ca2+ каналів Ca2+ входить в клітину (Рис.15). Вивільнення визначається загальною кількістю входячого Ca2+ і станом наповнення динамічного пулу, який залежить від базального [Ca2+]i передуючому стимулу. Цей результат не виключає, що інші види стимулювання клітини можуть привести до відповідей, в яких специфічність типу Ca2+ каналів має значення.

Двоступенева модель Ca2+-залежності секреції у хромафінних клітинах

Екзоцитоз є одним з головних клітинних процесів, які надають можливість клітині впливати на її оточення. Цей механізм лежить в основі міжклітинної комунікації в нервовій системі через виділення нейромедіаторів в синапсах і тому є основою для інтеграційної функції мозку. Добре відомо про залучення багаточисельних внутрішньоклітинних молекул в секреторний шлях. Проте, головний внутрішньоклітинний стимул для протікання екзоцитозу в збудливих клітинах є підвищення концентрації внутрішньоклітинного Ca2+ ([Ca2+]i ). Було показано, що Ca2+-залежність секреції має двоступінчастий характер, який може бути пояснений окремими моделями, такими як модель "пулів" в хромафінних клітинах (Neher & Zucker, 1993; Heinemann et al., 1993) або модель секреції "підготовчої стадії" в нервових терміналях (Seward et al., 1995). Недавно було запропоновано участь протеінкінази С в біфазному феномені (Smith et al., 1998). Модель "пулів" передбачає існування трьох везикулярних пулів і везикулярну "міграцію" від великого резервного до готового до вивільнення пулу, а потім до секреторних пулів. Було припущено існування великого резервного і готового до вивільнення пулів визначає двоступеневу секрецію із кубічною Ca2+-залежністю кінцевої секреторної відповіді. Модель "підготовчої стадії" описує два ступені – одна з них фаза, яка є "підготовчою стадією" для секреції і секреторна порогова фаза безпосередньо. "Підготовча стадія" служить Ca2+-залежною "ініціюючою ступінню секреції. "PKC модель" пояснює дві фази секреції PKC-залежними і незалежними процесами залежність від [Ca2+]i. В цьому розділі ми пропонуємо "везикулярний" механізм, який описує експериментальні дані, і показує значення цього феномену у функції секреторних клітин.

Loading...

 
 

Цікаве