WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки (автореферат) - Реферат

Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки (автореферат) - Реферат

Механізми регулювання поодиноких Ca2+ каналів фосфорилуванням

Високо порогові Ca2+ канали грають важливу роль в запуску і модуляціі в більшості метаболічних процесів в нервових клітинах і можуть бути суб"єктом істотного функціонального регулювання з боку широкого кругу різноманітних фізіологічних і фармакологічних агентів. Природні нейротрансмітори є одним з класів агентів, які впливають на активність Ca2+ каналу. В цьому відношенні 5-HT належить до філогенетичних найстаріших із них. Окремі публікації присвячені впливу 5-HT на активність Ca2+ каналу (Lukyanetz, 1991; Kostyuk et al., 1992; Kostyuk & Lukyanetz, 1993), які показали, що 5-HT здатний збільшувати Ca2+ провідність мембрани в нейронах. Наші попередні дані, отримані на педальних мотонейронах слимака Helixpomatia , показали, що 5-HT істотно збільшує амплітуду Ca2+ струму, (ICa) в цих нейронах, тоді як інша більшість нейронів має іншу чутливість (Lukyanetz, 1991; Kostyuk et al., 1992b; Kostyuk & Lukyanetz, 1993). Попередній аналіз механізму стимулюючоі дії 5-HT на Ca2+ канали педальних нейронів показав залучення cAMP-залежного фосфорилування в цей процес (Kostyuk et al., 1992a;). Проте, молекулярні механізми змін активності поодиноких Ca2+ каналів під час їх фосфорилування до сих пір не ясні. В цьому розділі, ми прагнули проаналізувати ці механізми на рівні функціювання поодиноких Ca2+ каналів під час їх 5-HT-індукованої та опосередкованої сАМР-залежним фосфорилуванням регуляціі в ідентифікованих педальних нейронах, використовуючи їх як модель.

Підсумовуючи цілослідження можна констатувати, що вивчаючи дію серотоніну (5-HT) на активність поодиноких Ca2+ каналів в ідентифікованих нейронах слимака pomatia Неlіх, ми встановили, що тільки один тип Ca2+ каналів із провідністю поодинокого каналу 5pS був визначений в умовах фіксаціїї мембранного потенціалу в конфігурації cell-atached (Рис.4). Кінетичний аналіз показав монотонно спадаюче розподілення часу відкритого стану каналу (OT) з середніми значеннями константи часу 0.2ms. Розподілення часу закритого (CT) каналу описувалось двох-експоненціальною кривою з константами часу 1 і 12ms. Ми встановили, що серотонін 5-HT діє на активність Ca2+ каналу не прямо, а через цитоплазматичні посередники. Ми встановили, що 5-HT подовжував відкритий стан каналу OT (до 0.3ms) і скорочував закритий стан каналу CT пропорційно для обох констант до 0.4 і 6 ms відповідно. Ми зробили висновок, що збільшення Ca2+ макроструму сАМР-залежним фосфорилуванням, визначається змінами кінетики, зростанням числа активних каналів і зростанням вірогідності знаходження каналів у OT. В той же час, 5-HT не впливав на провідність поодинокого каналу .

Роль дефосфорилування в регуляції активності Ca2+ каналів

Кальцинейрин або протеїнфосфатаза 2B (PP2B) є винятковою серед інших протеїнфосфатаз завдяки її високій Ca2+- і кальмодулінній-залежності (Klee & Nirenberg, 1974; Kincaid, 1993). Очевидно, що PP2B відіграє важливу роль у функціонуванні нервових клітин, оскільки вона широко розповсюджена саме в нервовій системі (Usuda et al., 1996). Одна з функцій PP2B може полягати в її участі у внутрішньоклітинній Ca2+ сигналізаціі, і потенціалозалежні Ca2+-канали, можуть бути її мішенню (Armstrong, 1989a; Kostyuk & Lukyanetz, 1993a). Тому було дуже важливо, виявити активність PP2B в нервових клітинах, таких як DRG нейрони і встановити можливу колокалізацію PP2B і Ca2+ каналів в цих клітинах. Для цього ми використовували специфічні антитіла до РР2В (anti-PP2B).

Підсумовуючи ці дослідження можна заключити, що ми детально проаналізували локалізацію кальцинейрину в нейрональних елементах за допомогою використання конфокальної мікроскопії і імуноцитохімічних підходів для вимірювання експресії РР2В в культивованих щурячих нейронах спинних корінців дорзальних гангліїв. Ми встановили, що що імунореактивність кальцинейрину надзвичайно виражена в DRG нейронах і що він локалізований переважно біля внутрішньої поверхні плазматичної мембрани (Рис.5). Імунопокрашення цих клітин антитілами anti- субодиниці потенціал-керованих Ca2+ каналів показало, що розподілення -субодиниці Ca2+ каналу і кальцинейрину дуже подібні (Рис.5). Отримані нами дані підтримують припущення, що функція кальцинейрину може бути безпосередньо пов'язана з активністю потенціалокерованих Ca2+ каналів.

Активність Ca2+ каналів в клітинах що оверекспресують РР2В

Ріст цитоплазматичної концентрації Ca2+ ([Ca2+]i ) являється одним із факторів, що запускає та сприяє процесу спаду (run-down) високо-порогових Ca2+ струмів, який спостерігається в петч-клемп дослідженнях. Проте, мало відомо про точний механізм дії Ca2+ на цей процес. Електрофізіологічні дослідження вже повідомляли, що один з шляхів, яким потенціалокеровані Ca2+ канали пригнічуються (down-регулюються) може відбуватися шляхом дефосфорилювання Ca2+ каналів. Декілька протеїн фосфатаз можуть бути задіяні в цей процес. Так, участь Ca2+/кальмодулін залежної фосфатази-2B (Chad & Eckert, 1986; Armstrong, 1989b; Kostyuk & Lukyanetz, 1993) та протеїн фосфатази типу 1 і 2A в down-регуляції Ca2+ були показані. Серед серін-треонінових фосфатаз, тільки PP2B є Ca2+-активованим ферментом і

таким чином, може виключно відповідати

за Ca2+-залежний компонент канального дефосфорилювання. Як було показано вище, після диференціації, NG108-15 клітини проявляють електрофізіологічні властивості дуже подібні до таких у симпатичних нейронів. Головна перевага цієї клітинної лініі - це ії здатність до гетерогенної експресії чужеродного генетичного матеріалу. Тому ми використовували NG108-15 клітини для оверекспресії в них PP2B і тестували результати змін в активності різних типів Ca2+ каналів представлених у цих клітинах.

Підсумовуючи результати цих досліджень можна зазначити, що в наших експериментах експресія PP2B в NG108-15 клітинах була змінена трансфекцією за допомогою конструкції плазмід, які містили повну довжину cDNA людської PP2B3 в сенс (CN15) та антисенс (CN21) оріентаціях (Рис.6). Конфокальна іммуноцітохімічна локалізація анти-РР2В показала, що в нативному типі клітин, PP2B іммунореактивність однорідно розподілена в не диференційованих клітинах і розміщується на внутрішній поверхні мембрани і нейрітах в диференційованих клітинах (Рис.7). Щоб тестувати Ca2+-залежність Ca2+ каналів, ми використовували високо-частотну стимуляцію (HFS) клітин, і встановили, що амплітуда L-типу і N-типу Ca2+ струмів зменшувалась на 37% і 52% відповідно, тоді як T-тип був тільки незначно чутливий до цієї процедури (Рис.9). FK-506 (2M), специфічний блокатор PP2B, зменшував пригнічення L- і N- типів Ca2+ каналів індуковане HFS на 30% і 33% відповідно. В трансфектних CN-15 клітинах оверекспрепресуючих PP2B, сумарні високопорогові (HVA) Ca2+ струми були пригнічені близько на 60% при тестовому потенціалі +20mV. Внутрішньоклітинне додавання EGTA або FK-506 в CN-15 трансфековані клітини індукувало 5 разове збільшення амплітуди HVA Ca2+ струмів (Рис.8). Отримані дані показали, що активність PP2B не впливає на експресію HVA Ca2+ каналів, але модулює їх функцію Ca2+-залежним дефосфорилюванням і що головною мішенню РР2В є Ca2+ канали N-типу. Наші результати також засвідчують, що HVA Ca2+ канали знаходяться в фосфорильованому стані в контрольних умовах і що РР2В залучена в негатитвну регуляцію Ca2+ каналів.

УЧАСТЬ Ca2+ КАНАЛІВ В РЕГУЛЯЦІЇ Ca2+-ЗАЛЕЖНОГО ЕКЗОЦИТОЗУ

Морфологічні особливості секреторних везикул хромафінних клітин

Не дивлячись на численні дослідження, присв'ячені процесу екзоцитозу або секреції катехоламінів із надниркових хромафінних клітин, в яких використовувалися різні експериментальні підходи (Gillis, 1995) існує дуже небагато детальних морфологічних аналізів їх секреторних гранул і везикул. Проте, очевидно, що походження і поведінка різних типів секреторних органел досить складні і залучають численні біохімічні процеси для синтезу різних субстанцій, що вивільняються із хромафінних клітин. Дослідження показали, що ці нейроендокринні клітини вивільняють моноаміни і ацетілхолін (ACh) із різних секреторних везикул, припускаючи, що транспортні протеїну, відповідальні за упаковку цих нейромедіаторів, розподілені серед різних везикулярних компартментів. Дійсно, не кажучи про головні секреторні везикули - великі щільні везикули (LDCVs) та синаптично-подібні мікровезикули (SLMV) які були знайдені в перероджених пухлинних хромафінних клітинах (PC12 клітини) та в SIF клітинах (клітини малої інтенсивності флуоресцентні). Різні синтезовані матеріали розподіляються між цими двома видами везикул різними способами. Так, катехоламіни, нуклеотиди, ліпіди і пептіди знаходяться в LDCVs тоді як ацетилхолін (ACh) присутній в SLMV. Більше того, спеціалізовані везикулярні системи, для синтезу катехоламінів і ACh і їх трансортування присутні в різних везикулах. Тому, метою цього розділу було дослідити за допомогою електронної мікроскопії морфологічні особливості секреторних везикул в хромафінних клітинах бика та їх поведінку під час екзоцитозу індукованого деполяризацією.

Loading...

 
 

Цікаве