WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки (автореферат) - Реферат

Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки (автореферат) - Реферат

Вимірювання кисню в електрофізіологічних експериментах

В експериментах та медичній практиці часто застосовують безпосереднє вимірювання кисню в тканинах або біологічних розчинах використовуючи електрохімічні методи за допомогою платинового електроду, на якому відбувається відновлення кисню (Рівняння 1).

O2 + 4e- +4H+  2H2O (1)

Схематичне зображення принципу вимірювань рО2 платиновим електродом під час електрофізіологічного експерименту представлено на Рис.1. Для експериментальних електрофізіологічних досліджень в основному використовується платиновий вимірювальний електрод із скляною ізоляцією діаметром 0.3  0.5 мм. Найважливішою характеристикою платинового електроду є його полярографічна характеристика - полярограма. Полярограма відображає залежність електродного струму (Іе) від прикладеного електродного потенціалу (Ue) і має нелінійну форму із явно вираженим плато, при якому і проводять вимірювання.

Полярограма має складну форму, що пояснюється електрохімічними властивостями електроду та фізичними процесами, такими як формування подвійного електричного шару, ємнісний та Фарадеївський струми та ін. Оскільки амплітуда струму на електроді залежить від вмісту кисню в розчині, то підвищення pO2 приводить до лінійного зростання амплітуди Іе. Таким чином, знаючи коефіцієнт нахилу залежності Іе від pO2,, можна вимірювати абсолютне значення pO2 у розчині. Властивості та характеристики платинового електроду та методів вимірювання pO2 детально описані в ряді робіт (Konovalenko et al., 1975; Lukyanetz & Shkryl, 2003).

Амперометрія

За допомогою конфігурації "амперометрія" ми реєстрували процес секреції з найбільшою часовою роздільною здатністю. При прикладанні постійної напруги 600800мВ на електрод з карбоновим волокном, який занурений в фізіологічний розчин, виникає електричний струм, що повільно затухає протягом декількох сотень секунд. Цей струм виникає через процес заряджання ємності подвійного шару та окислення певних компонент поверхні електроду. Після приблизно 5 хвилин загальний струм стабілізується та складає звичайно 510пА. За таких умов можна розпочинати досліди. Для таких електродів рівень шуму складає в середньому 0.51.5пА при ФНЧ (3-полюсний фільтр Бесселя) 3кГц (використовуючи підсилювач ЕРС-9 при коефіцієнті підсилення 20мВ/рА).

Електрод з карбоновим волокном електричне можна представити як резистор, послідовно сполучений з паралельним з'єднанням опору та ємності. Цей послідовний опір складає 100500к0м та виникає через контакт між карбоновим волокном та розчином електроліту 3М КС1 (опір самого волокна є незначним і складає всього 34к0м/см) та ємністю порядку 340пФ. Паралельний опір складає 10100Гом та залежить від степені обрізання кінчика електроду. В якості допоміжного (індиферентного) електроду найкраще всього використовувати хлор-срібний електрод.

Вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію

Для вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію ([Са2+]і) ми використовували кальцій-чутливий барвник Fura-2 AM (Molecular Probes, США), що має здатність проникати через клітинну мембрану (Grynkiewicz et al., 1985). Якщо Fura-2 присутня в досить високій концентрації всередині клітини, вона витісняє всі ендогенні кальцієві буфери і дозволяєвимірювати загальну кількість іонівкальцію, щовходять всередину клітини.

Клітини інкубували протягом 30 хв.притемпературі 37°С в зовнішньоклітинному розчині, що містив12 MFura-2 АМ. Післяцього клітини відмивались чистим зовнішньоклітинним розчином і залишали в темряві при кімнатній температуріна 3040 хвилин для завершальної деестерифікації Fura-2 АМ. ЧашкаПетрі з клітинами розташовуваласьв полі зору інвертованого мікроскопу OlympusІХ70 (Токіо,Японія). Для реєстрації кальцієвих транзієнтів, які виникали внаслідок стимуляції клітини певним розчином,використовувався підсилювач ЕРС-9(НЕКА, Ламбрехт, Німеччина). Керування процесами вимірювання, а також запису даних контролювавсяза допомогою комп'ютерної програми "Pulse" та „Х-chart" (НЕКА, Ламбрехт, Німеччина). Длязміни зовнішньоклітинних розчинів навколо вибраної клітини була застосована система локальної аплікації. Швидкість зміни розчину складала 0.3 мл/хв. В робочому режимі збудження флуоресцентного зонду здійснюється при довжинах хвилі 360 (F1) та 380 (F2) нм за допомогою монохроматора. Реєстрація емісії зонда проводилась в діапазоні 510 нм за допомогою фотопомножувача. Сигнали з фотопомножувача подавали на вхід ЕРС-9, який в реальному масштабі часу розраховував відношення флуоресцентних сигналів на двох довжинах R=F1/F2. Отримані експериментальні дані оцифровувались та зберігались на жорсткому диску комп'ютера для наступної обробки.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

РЕГУЛЯЦІЯ АКТИВНОСТІ Ca2+ КАНАЛІВ

Біофізичні властивості Ca2+ каналів на прикладі NG108-15 клітин

Клітинна лінія нейробластомигліоми NG108-15 - це гібридна моноклональна клітинна лінія, штучно сформованої злиттям двох окремих ліній, нейробластоми миші і лінії щурячих клітин гліоми. Після диференціювання клітин за допомогою простагландіну E1, NG108-15 клітини показують електрофізіологічну і фармакологічну схожість до споріднених їм симпатичних нейронів. Завдяки цим властивостям, NG108-15 клітини можуть слугувати зручною модельною системою для дослідження властивостей іонних каналів і як могутній інструмент для експресії чужого генетичного матеріалу, щоб впливати на різні функції нейрону включаючи активність Ca2+ каналів. В цьому розділі ми виконали детальну кількісну оцінку компонентного складу і властивостей LVA і HVA Ca2+ каналів цих клітин, і вперше опиcали петч-клемп дослідження, що показали, що NG108-15 клітини експресують четвертий тип Ca2+ каналів - залишковий компонент, який дуже подібний до LVA струму активацією і кінетикою інактивації, проте, поріг його активації лежить ближче до компонентів HVA струму, і може належати до Q-типу каналів.

Підхід, який звичайно використовується для оцінки внеску компонентів струму – є вимірювання значення піку фармакологічно розділених Ca2+ струмів при потенціалах, що відповідають максимуму I-V кривої. Цей вид аналізу не оптимальний, тому що в багатоскладових струмах асиметрична форма I-V кривих для різних компонентів і відносних переміщень їх максимумів може давати реальні помилки в оцінці їх внеску. Ми, таким чином, оцінювали Ca2+ інтеграл I-V відношення (Ca ) який прямо пропорційний до значення амплітуди Ca2+ струму при даному потенціалі мембрани, і відображає загальну кількість Ca2+, який може входити в клітину під час ремп-деполяризації мембрани. Ми вираховували Ca як інтеграл густини струму, узятий уздовж I-V кривої :

(2)

де ICaє амплітуда Ca2+ струму, Cm - це ємність мембрани, Vo і Vt є початковим і кінцевим значеннями тестового потенціалу і V є потенціал мембрани.

Як можна бачити із Рис.2, що на відміну від недиференційованих клітин, Ca2+ вхід через Ca2+ канали (вирахований як Ca) в клітину під час деполяризації, збільшується близько в 13 разів в сферичних "диференційованих" і близько в 30 разів в клітинах з нейритами.

Підсумовуючи результати можна зазначити, що використовуючи інтеграл вольт-амперних залежностей, як нову оцінку складових компонентів Ca2+ струму в гібридних NG108-15 клітинах ми визначили істотні зміни в значеннях і композиції Ca2+ струмів під час клітинної диференціації (Рис.2). Тільки низькопорогові Ca2+ струми могли спостерігатися в недиференційованих клітинах; після диференціювання клітин з'являлися високопорогові Ca2+ струми і загальний Ca2+ струм збільшувався близько в 30 разів. Застосовуючи фармакологічні і біофізичні методи розділення струмів, ми визначили чотири головні типи Ca2+ каналів в диференційованих клітинах: приблизно 50%, 20%, 17% складали N-, T-, L-типи відповідно і 12% залишковий струм, який позбавлений чутливості до класичних блокаторів LVA і HVA струмів, за винятком CTxMVIIC (Рис.3). Ми встановили, що всі струмові компоненти показали кінетику і фармакологічні властивості, подібні до нейрональних клітин. Ми також встановили істотну Ca2+-залежність дії CTxGVIA для пригнічення N-типу Ca2+ каналів - 10mM Ca2+ в омиваючому розчині зменшував в три рази ефективність токсину до блоку N-каналів. Залишковий компонент, за своїми особливостями підходив до властивостей Ca2+ каналів Q-типу: він був чутливим до CTxMVIIC і був дуже подібним до Ca2+ каналів T-типу кінетикою, проте, поріг активації був ближчим до HVA компонентів (-40mV). Наші результати показують функціональну різноманітність Ca2+ каналів і вперше продемонстрували, що в NG108-15 клітинах експресується ймовірно Q-тип Ca2+ каналів 1A сім'ї, який має біофізичні і фармакологічні властивості, які відрізняються від таких описаних раніше для T-, L- і N-типів в цих клітинах.

Loading...

 
 

Цікаве