WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки (автореферат) - Реферат

Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки (автореферат) - Реферат

Ферментативне виділення окремих DRG нейронів

Експерименти, також проводились на гостроізольованих нейронах гангліїв дорзального корінця білих щурів лінії Вістар віком 1,5-2 місяці, що утримувались на стандартній лабораторній дієті у віварії Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. Для отримання клітин використовувалась стандартна процедура ферментативної ізоляції. Щура декапітували під легким ефірним наркозом. З області хребта хірургічним шляхом видалялась шкіра та м'язи, хребет розсікався навпіл в горизонтальній площині та виділялися грудні та поперекові спинномозкові ганглії, які поміщалися у чашку Петрі з охолодженим до 4 С розчином DPBS з глюкозою. Після 2-3 хвилин охолодження ганглії переносилися у розчин Tyrode, що містив ферменти колагеназу (тип ІА, Sigma, США) в концентрації 0.5 мг/мл та протеазу (тип XIV, Sigma, США) в концентрації 1 мг/мл, в якому витримувалися на протязі 25-30 хвилин при температурі 37С. Для отримання суспензії клітин ганглії піпетувалися за допомогою Пастеровських піпеток різного діаметру у 0.5 мл розчину Tyrode. Отриману суспензію витримували у чашках Перті на протязі 20-30 хвилин для закріплення клітин до дна чашки.

Культура клітин гіпокампу

Первинна культура нейронів гіпокампу готувалася з новонароджені щурів лінії Вістар. Тваринні декапітувались і їх мозок поміщався у фосфатно-буферний розчин Процедура декапитації проводилася при дотриманні правил використовування піддослідних тварин Національної Академії Наук України. Цілий гіпокамп виділявся, зрізи гіпокампу нарізалися завтовшки 450-550 мкм. Після 10-хвилинної обробки 0.025% трипсином у фосфатно-буферному розчині при 34°С, тканина промивалася 4 рази в мінімальному середовищі Ігла (Sigma) з додаванням кінської сироватки (10%) (Gibco). В цьому розчині клітини були механічно дисоційовані за допомогою Пастерівських піпеток. Для електрофізіологічних експериментів ми вибирали, під візуальним контролем, пірамідні нейрони гіпокампу.

Виділення нейронів слимака

Експерименти були виконані на нейронах дорзальної і вентральній поверхні підглоткового комплексу гангліїв виноградного равлика Helix роmatia. Тварини містилися в прохолодних тераріумах віварію. Не менше ніж за тиждень до експерименту молюски переносились в приміщення з температурою повітря +18+20C, де вони находились в добре аеруємому вологому боксі. Препарування нейронів равликів здійснювалося безпосередньо перед дослідом і полягало у витяганні навкологлоткового кільця гангліїв. Для видалення щільних сполучнотканинних оболонок, що покривають нейрони, препарат інкубували в нормальному розчині Рінтгера, що містив 1% пронази, на протязі 90 хвилин при температурі 37С. Пом'ягчені проназою сполучнотканинні оболонки легко віддалялися за допомогою мікропінцету і мікроножиць під контролем бінокулярного мікроскопа. Після відмивання ферменту розчином Рінтгера, клітини поміщалися в холодильну камеру для інактивації дії ферменту і знаходилися там при температурі +4C до початку експериментів. Нервові клітини такого препарату володіли нормальною активністю і високим опором мембрани.

Ідентифікація педальних нейронів

Разом з використовуванням в дослідах неідентифікованих нейронів, в більшій частині експериментів застосовували ідентифіковані нервові клітини - "педальні нейрони", отримані по спеціальній методиці. Після звичайної ферментативної обробки препарату навкологлоткового кільця гангліїв, з його вентральної поверхні вирізувалися невеликі ділянки педальних гангліїв. Ці ділянки включали нейрони, прилеглі до групи нервів (VIII - X), розташованих в цій області ганглія (згідно схемі Кіліаса, що виходять. Надалі нейрони, локалізовані в цих фрагментах, після їх механічного виділення, використовувалися для остаточної ідентифікації по наявності стимулюючої дії 5-НТ на ICa вже в ході електрофізіологічного експерименту.

Культивування гібридних клітин NG108-15

Культуральне середовище складалося із 90% MEM, 10% FCS (ембріональна сиворотка теляти), НАТ (хіпоксантін-аміноптерін-тімідін) добавки і пеніцилін-стрептоміціну. За день до диференціаціі NG108-15 клітини були перенесені на скляні скельця. Клітини були диференційовані, використовуючи стандартні процедури, описані раніше шляхом обробки клітин 10 ?М простагландіном E1 (PGE) і 50 М ізобутілметілксантіном (IBMX) за 3-5 днів до вимірювання. PGE і IBMX були присутні тільки протягом початкової 48 годин диференціації. Пізніше середовище було змінене на MEM + 1% FCS + НАТ добавка. В усіх електрофізіологічних експериментах піпеточний розчин містив 0.1 mM IBMX, щоб запобігти Ca2+-залежну фосфодістеразну активність. Присутність IBMX ніяким чином не впливала на інтерпретацію даних, тому що обидві як недиференційовані так і диференційовані, а також "дикі" типи і трансфековані клітини оброблялися цим інгібітором.

ОСНОВНІ МЕТОДИ

В роботі використовувався ряд методів, а саме: електрофізіологічні методи (фіксація мембранного потенціалу, вимірювання активності поодиноких каналів та вимірювання ємності мембрани), полярографічний та амперметричний методи, імуноблот аналіз, метод трансфекції, імуноцитохімії, конфокальної та електронної мікроскопії, мікрофлуоресцентний метод. Нижче приведено описання основних із них.

Методи фіксації мембранного потенціалу

В даній роботі для реєстрації кальцієвих струмів мембрани нейронів гіпокампу використовувався метод patch clamp в конфігурації whole сеll. Експериментальну камеру з прикріпленими до дна клітинами встановлювали в камеру поміщену на предметному столику інвертованого мікроскопу з оптикою (Olympus, Японія). Скляні мікропіпетки виготовлялися з боросилікатного скла (зовнішній діаметр 1.75 мм), використовуючи витягував піпеток P-97 фірми Sutter Instruments. Після оплавлення піпетки отримували діаметр кінчика 1 - 2 мкм і опір 2 - 3 М при заповненні стандартним "внутрішньоклітинним розчином". Піпетку зєднували до вхідної головки підсилювача Dagan PC-One (Dagan Corp., США) або EPC-9 (HEKA Electronics, Німеччина). Утворення гігаомного контакту контролювали в режимі фіксації потенціалу, подаючи на мембрану прямокутні гіперполяризуючі імпульси амплітудою -10 мВ. Після утворення "сеll attached" конфігурації компенсували ємність піпетки. "Whole сеll" конфігурацію одержували, прориваючи мембрану під піпеткою імпульсами негативного тиску, після чого записували ємнісний струм у відповідь на гіперполяризуючий імпульс амплітудою -10 мВ і обчислювали ємність клітини за формулою: Cm = Q/10 де Q - інтеграл струму ємності, Cm - ємність клітинної мембрани.

Сигнал фільтрували при частоті зрізу 3 кГц за допомогою 3-х полюсного фільтру Бесселя і 10 kHz цифровим фільтром. Комп'ютерна система забезпечувала також генерацію командних імпульсів. Збір даних і їх аналіз здійснювався за допомогою програмного забезпечення PULSE (HEKA Electronics, Німеччина). Статистичні відмінності були оцінені дисперсійним аналізом (Анова) з рівнем значущості P.

Вимірюванняємності мембрани

Ємність (Cm) мембрани безпосередньо пропорційна до площі зовнішньої мембрани; тому зміни в Cm відображають процес ексоцитозу. Ми використовували метод Lindau і Neher (Lindau & Neher, 1988) для вимірювання ємності застосовуючи синусоїдний стимул, накладений на DC підтримуємий потенціал - 70mV в режимі whole-cell. 1KHz, синусна хвиля величиною 10 mV до піку генерувалася багатоканальним інтерфейсом (Instrutech, Inc., NY) ITC-16, контрольованим комп'ютером Maкiнтoш Quadra 700. Генерація синусної хвилі як і компенсація основної частини ємності клітини і фазочутлива детекція Cm була досягнута з програмним забезпеченням "Lock-in amplifier", контрольованим програмним забезпеченням "Pulse" (HEKA Elektronics). Використовувалася різниця в Cm (Cm) до і після деполяризуючих імпульсів, для того щоб виміряти екзоцитоз протягом імпульсів (Neher & Marty, 1982c; Gillis, 1995). Cm був вирахований off-line, тобто після експерименту, як різниця між середніми препімпульсними Cm на протязі 50 ms вікна перед деполяризацією і середньою величиною Cm, виміряною під час 500ms вікна після кінця деполяризації. Аналіз даних виконувався програмним забезпеченням, написаним в коді макрокоманд IgorPro (WaveMetrics, Inc., Like Oswego, орегон) нами (ООЛ), а також використовувався код, написаний доктором K.D. Gillis.

Loading...

 
 

Цікаве