WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки (автореферат) - Реферат

Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки (автореферат) - Реферат

Ключові слова: амперометрія, дефосфорилування, гіпоксія, епілепсія, екзацитоз, кальцієві канали, кальцієва сигналізація, кальцинейрин, секреторні везикули, трансфекція, фосфорилування.

Лукьянец Е.А. Роль кальциевых каналов в функционировании нервных и нейроендокринних клеток в норме и патологии. – Рукопись.

Диссертация на снискание научной степени доктора биологических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвященна исследованию роли Ca2+ каналов в функционировании нервных и нейроендокринных клеток в норме и патологии. В работе были исследованы биофизические и фармакологические свойства потенциалозависимых Ca2+ каналов и их экспрессия в процессе клеточной дифференциации. Особое внимание было уделено особенностям регуляции Ca2+ каналов путем их фосфорилирования и дефосфорилирования. С одной стороны, был исследован механизм увеличения Ca2+ макротока вызванного фосфорилированием каналов. С другой стороны, исследование дефосфорилирования Ca2+ каналов при участии Ca2+-зависимой протеинфосфатазы кальцинейрина (РР2В) показало, что активность PP2B не влияет на экспрессию высокоророговых (HVA) Ca2+ каналов, но значительно подавляет их функцию. Исследование роли Ca2+ каналов в регуляции процесса высвобождения нейротрансмиттеров (екзоцитоза) показало, что не важно, через какой тип Ca2+ каналов Ca2+ входит в клетку, и что экзоцитоз определяется общим количеством Ca2+ который поступает в клетку и базального [Ca2+]i предшествующего стимулу. Был предложен везикулярний механизм, описывающий экспериментальную двухступенчатую зависимость екзоцитоза от [Ca2+]i. Значительная часть работы была посвящена роли Ca2+ каналов в механизмах патологичных состояний ЦНС – гипоксии/ишемии и эпилепсии на модельных системах нейронов крыс. Мы установили, что гипоксия вызывала существенное повышение [Ca2+]i. Полученные данные позволяют допустить, что Ca2+ каналы могут быть первичными структурами для гипоксического действия на нейроны, изменения активности которых вторично вызывают нарушение других функций. Наши исследования роли Ca2+ каналов в развитии эпилепсии путем изучения механизмов действия антиэпилептического препарата леветерацитама (LEV), показали, что LEV селективно и необратимо подавлял Сa2+ ток N-типа и позволили предположить существование подтипа этих каналов, чувствительных к LEV, которые могут быть вовлечены в молекулярную основу его антиепилептического действия. Сделан вывод, что Ca2+ каналы играют существенную роль в функциювании нервных и нейроендокринных клеток в норме и патологии.

Ключевые слова: амперометрия, дефосфорилирование, гипоксия, эпилепсия, екзацитоз, кальциевые каналы, кальциевая сигнализация, кальцинейрин, секреторные везикулы, трансфекция, фосфорилирование.

Lukyanetz E.A. Role of calcium channels in function of neuronal and neuroendocrine cells in norm and pathology. – Manuscript. Dissertation for doctor of sciences degree by speciality 03.00.02 – biophysics. A.A. Bogomoletz Institute of Physiology, NAS of Ukraine, Kiev, 2005.

Dissertation is devoted to researches the role of calcium channels in functioning of nervous and neuroendocrinne cells in norm and pathology. In this studies the biophysical and pharmacological properties of voltage-operated calcium channels and their expression in the process of cellular differentiation were explored. The special attention was spared to the features of the Ca2+ channel regulation by their phosphorylation-dephosphorylation. From the one side, a mechanism of increase of Ca2+ macrocurrent caused by phosphorylation of channels was explored. It appeared that this increase of Ca2+ macrocurrent is determined by the changes in kinetics, increase of number of active channels and increase of staying of single channels in the opened state. At the same time, no changes in conductivity of the single Ca2+ channels were observed. The study of dephosphorylation of Ca2+ channels with possible participation of Ca2+-dependent protein phosphatase calcineurin (PP2B) showed a colocalization of PP2B and calcium channels in a cellular membrane of DRG neurons. The PP2B overexpression in the NG108-15 cells was achieved by means of transfection with plazmid containing cDNA of human PP2B. It appeared that in such transfectants the PP2B activity does not affect expression of the high-voltage activated (HVA) Ca2+ channels, but considerably supress their function by means of Ca2+-dependent dephosphorylation and that PP2B operates mainly N-type Ca2+ channels in these cells. Exploration the role of Ca2+ channels in regulation of neurotransmitter release (exocytosis) showed that for prolong stimuli which liberate a part of the readily releasable pool of vesicles, it is not so important through which type of channels Ca2+ enters the cell. Release is rather determined by the total amount of Ca2+ entering and by the filling state of the pool, which depends on basal [Ca2+]i before the stimulus. We established that depolarization-induced exocytosis passed over two steps both of which linearly depend on [Ca2+]i. At [Ca2+]i lying below critical point (200  300 nM) the slope of the relationship was 4.43 and at [Ca2+]i exceeding the critical point the slope was equal to 31.63. The vesicular mechanism describing experimental two-step dependence of exocytosis on intracellular Ca2+ is proposed. According to the model at [Ca2+]i below critical point only small sized vesicles fuse with plasma membrane whereas at higher Cai, larger vesicles started to fuse. Considerable part of work was devoted to the role of the Ca2+ channels in development and passing of series of pathological states CNS – hypoxia/ischemia and epilepsy on the model systems of neurons of rats. We established that hypoxia has caused a substantial rise of the intracellular Ca2+ level already after a few seconds after the beginning of its action. Our finding allow to assume that the voltage-operated calcium channels of plasma membrane can be the initial structures for hypoxic action on the explored neurons, the changes of activity of which induce the secondary violation of function of ionexchanging machineries of plasma membrane. Using the whole-cell patch-clamp and measuring of partial oxygen pressure methods, we established that moderate hypoxia rendered double action on the Ca2+ channels: intracellular-mediated increase of calcium entrance through the Ca2+ channels and their Ca2+-dependent inactivation. At the same time, we established a dependence of hypoxic effect on concentration of external Ca2+ and found out a saturation of hypoxic effect. We assumed that the hypoxic effect can be related to growth of channel conductivity, and the level of Ca2+ channel conductivity at normoxia can determine the value of hypoxic effect. Selective blokers of HVA Ca2+ channels were used for studies of sensitivity of HVA Ca2+ channels subtypes in the CA1 hippocampal neurons of rats to the O2 shortage in environment. We established that both types of the HVA Ca2+ channels are sensible to hypoxia, however L-type was approximately in 3.5 times more sensitive to the decline of the O2 level. Our investigations of the role of Ca2+ channels in development of other pathological state of CNS – epilepsy, we conducted by studies of action mechanism of known antiepileptic substance of leveteracetam (LEV). Our researches showed that LEV selectively and not reversible suppressed the N-type HVA calcium current. In addition, our data allowed to assume an existence of subtype of the N-type Ca2+ channels sensitive to LEV, which can be engaged in the molecular basis of its antiepileptic action. We concluded, that Ca2+ channels play a substantial role in functioning of nervous and neuroendocrinne cells in norm and pathology.

Key words: amperometry, dephosphorylation, hypoxia, epilepsy, exocytosis, calcium channels, calcium signalling, calcineurin, secretory vesicles, transfection, phosphorylation.

Loading...

 
 

Цікаве