WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Удосконалення транспортного обслуговування вантажовласників у транспортних вузлах (автореферат) - Реферат

Удосконалення транспортного обслуговування вантажовласників у транспортних вузлах (автореферат) - Реферат

Цікаво, що чим вищою була концентрація токсину, тим меншою ставала чутливість його впливу до ФАО (так само, як і до циклоспорину А в попередніх експериментах). Отже, із зростанням концентрації токсину в реалізації його дії зростає внесок фактора, нечутливого до ФАО. Цим фактором може бути пасивний вихід нейромедіатора через пори, сформовані токсином у плазматичній мембрані, або вихід внаслідок оберненої роботи ГАМК-транспортера плазматичної мембрани.

Припущення про цитозольне джерело вивільнюваної -латротоксином ГАМК підтвердили результати подальших експериментів, в яких вплив ФАО вивчався на синаптосомах з попередньо виснаженим цитозольним пулом медіатора. В препараті, обробленому ніпекотиновою кислотою, [3H]ГАМК представлена в основному везикульованим пулом, на який і діє інгібітор. За цих умов чутливість до ФАО нейросекреції, стимульованої і високою, і низькою концентраціями -LTХ, було подібною. Це свідчить про те, що чутливість до ФАО виявляє лише процес екзоцитозу. І "внесок" екзоцитозу до дії токсину в даному разі, швидше за все, є практично однаковим, незалежно від концентрації -LTХ.

Важливо зазначити, що в усіх проведених експериментах інгібітор діяв на вихід [3H]ГАМК, викликаний токсином, незалежно від присутності позаклітинного Са2+. Отже, фактор наявності Са2+ в середовищі не визначає здатності токсину вивільнювати нейромедіатор із цитозолю. Найбільш імовірно, що інтенсивність витікання медіатору залежить лише від кількості утворених у мембранілатротоксинових каналів, що в свою чергу залежить від використаної концентрації токсину.

Ці результати суперечать висновкам Ashton et al. (2001), які припустили, що в лише безкальцієвому середовищівідбувається вихід нейромедіаторів із цитозольного пулу через латротоксинові пори. Але узгоджуються з даними Hlubek et al. (2000), Volynski et al. (2000), які показали, що проникні властивості згаданих пор визначає сама молекула токсину, а не тип рецептора (до Са2+-залежного нейрексину 1 чи до Са2+-незалежного латрофіліну), до якого вона приєдналась.

4. Відповідь на -LTX синаптосом з виснаженим везикульованим пулом ГАМК

Наступний етап досліджень передбачав проведення експериментів на синаптосомах зі зміненим везикульованим пулом ГАМК. Ми використали агенти, які, викликаючи активний вихід нейромедіатора з синаптичних везикул, спричиняють його перерозподіл між везикульованим та цитозольним пулами, збільшуючи вміст останнього. Це були протонофор FCCP та інгібітор Н+-АТФази синаптичних везикул бафіломіцин А1. Якщо дія -LTХ спрямована на різні пули, то можна припустити, що такий перерозподіл [3H]ГАМК змінюватиме співвідношення між внесками кожного з механізмів дії токсину.

У всіх попередніх дослідженнях ми вимірювали вивільнення [3H]ГАМК, стимульоване 0.5 нМ -LTХ за час, що не перевищував 5 хв. В експериментах із FCCP продовження інкубації з -LTХ до 10 хв дозволило виявити певні особливості механізму дії токсину, пов'язані з виходом [3H]ГАМК з невезикульованого пулу. Виснаження везикул і, відповідно, збагачення цитозольного пулу нейромедіатора спричиняло зникнення (або значне зниження) вивільнення [3H]ГАМК, що спостерігається протягом перших 2 хв дії -LTХ, але вже на 5-тій та особливо на 10-тій хв кількість вивільненої мітки різко зростала.

Кінетика процесу в експериментах з FCCP відрізнялася залежно від використаної концентрації токсину. Максимум активності токсину, пов'язаної зі стимулюванням екзоцитозу, спостерігався протягом перших 2 хв для всіх концентрацій -LTХ, але момент початку другої стадії вивільнення нейромедіатора залежав від використаної концентрації токсину. Для наномолярного -LTХ він майже збігався з моментом закінчення першої стадії, а для субнаномолярного – наставав лише на 5-ту хв.

Досліди з макролідним антибіотиком бафіломіцином А1 підтвердили, що на різних етапах дії -LTХ реалізуються різні механізми вивільнення [3H]ГАМК. Нейросекреція, що відбувається протягом перших 2 хв дії токсину була дуже чутливою до бафіломіцина А1, що свідчило про те, що на цьому етапі вихід [3H]ГАМК відбувається шляхом екзоцитозу. Другий етап (через 5 хв дії -LTХ) характеризувався практичною нечутливістю до дії використаного інгібітора, вказуючи на інше джерело вивільнюваної [3H]ГАМК – цитозоль. Важливо зазначити, що були отримані практично ідентичні результати в середовищі з Са2+ та без Са2+. Це підтверджує наші попередні висновки про те, що -LTХ не потребує наявності позаклітинного Са2+ для стимуляції вивільнення нейромедіатора.

Якщо -LTХ вивільняє ГАМК із цитозолю, то постає логічне питання: яким є механізм такого виходу. Одним з можливих шляхів є витікання ГАМК через пори, які формує токсин у плазмалемі. Іншим імовірним механізмом є обернена робота ГАМК-транспортера плазматичної мембрани. Участь цього транспортера у відповіді синаптосом на -LTХ на сьогодні є зовсім недослідженою.

Щоб з'ясувати це питання ми використали NO-711, несубстратний блокатор ГАМК-переносника плазматичної мембрани, який пригнічує як вхід, так і вивільнення нейромедіатора, зупиняючи транспорт ГАМК на проміжному етапі.

Проведені експерименти з інгібітором NO-711 підтвердили, що ГАМК-транспортери залучені -LTХ-стимульованого вивільнення [3H]ГАМК, а точніше до другого етапу цього процесу (після 2 хв дії токсину). NO-711 пригнічував вивільнення [3H]ГАМК, стимульоване як низькими, так і високими концентраціями -LTХ. Хоча кінетика цього процесу відрізнялася для різних концентрацій токсину.

Для того, щоб секретогенна дія -LTХ ставала чутливою до блокатора ГАМК-транспортера, у всіх експериментах необхідний був деякий час, який залежав від концентрації токсину. Протягом цього лаг-періоду, ймовірніше за все, відбувається формування токсинових пор у клітинній мембрані, а тривалість цього процесу залежить від концентрації -LTХ (Гиммельрейх и др., 1990). З одного боку, вхід через ці пори дивалентних катіонів викликає швидку деполяризацію пресинаптичної мембрани, що може бути достатнім для помітного виходу ГАМК завдяки оберненій роботі ГАМК-переносників. З іншого – через дані пори, які проникні також і для невеликих молекул, може частково витікати і вільна цитозольна ГАМК. Цим можна пояснити неповне пригнічення NO-711 виходу [3H]ГАМК, стимульованого 0.5нМ LTХ. Таким чином, токсинові пори можуть відігравати подвійну роль в цьому процесі – пряму і непряму. Хоча не можна відкидати і можливість безпосередньої взаємодії молекули -LTХ та мембранного переносника нейромедіатора.

ВИСНОВКИ

  1. -Латротоксин завдяки своїй здатності стимулювати потужне вивільнення нейромедіаторів з пресинаптичних нервових закінчень є широко вживаним інструментом для фундаментальних досліджень нейросекреції. Особливий інтерес викликає секретогенна дія -LTX в середовищі без Са2+. Гостро дискусійним є питання щодо здатності токсину залучати до секреторного процесу цитозольний (невезикульований) пул нейротрансмітерів, а також щодо того, як реалізується така дія токсину. Розв'язання цієї проблеми вимагає застосування нових методичних підходів.

  2. Показано, що α-LTХ здатен специфічно стимулювати процес екзоцитозу у вільному від Са2+ середовищі за умов виснаження цитозольного пулу ГАМК внаслідок пермеалізації синаптосом дигітоніном.

  3. З використанням конкурентних інгібіторів транспортера ГАМК (ніпекотинової кислоти та 2,4-діамінобутирату), які модулюють вміст ГАМК у цитозольному пулі шляхом гетерообміну, продемонстрована здатність α-LTХ стимулювати вивільнення ГАМК за рахунок не лише активації екзоцитозу, але і залучення вільного цитозольного нейромедіатора

  4. Досліджено секретогенну дію -LTX за умов модулювання процесу екзоцитозу інгібіторами протеїнфосфатаз. Показано, що окадаєва кислота (інгібує ПФ 1 та 2А) та циклоспорин А (інгібує ПФ 2В) посилюють стимулювальну дію -LTХ. Чутливість до циклоспорину А знижується із зростанням використаної концентрації α-LTХ (тобто із залученням цитозольної ГАМК до процесу секреції). Водночас, окадаєва кислота помітно пригнічує секретогенний ефект 4-амінопіридину, а циклоспорин А, навпаки, його підвищує. Отже, механізми нейросекреції, викликаної токсином і 4-АП, певним чином відрізняються.

  5. Вивчено дію -LTX за умов інгібування ФІ-4-кінази (важливої для здійснення екзоцитозу) феніларсен оксидом. Показано, що ФАО відчутно пригнічує секрецію, стимульовану субнаномолярним -LTX, або у разі дії токсину на синаптосоми з виснаженим цитозольним пулом ГАМК (у цих випадках дія -LTX реалізується шляхом екзоцитозу). Дія високих концентрацій -LTX, які спричиняють не лише стимуляцію екзоцитозу, мало чутлива до ФАО. Залежність ступеню інгібування секреторного процесу від концентрації -LTX  ще одне свідчення здатності токсину індукувати різні шляхи вивільнення нейромедіатора.

  6. Вивчено, як впливає перерозподіл ГАМК між везикульованим і цитозольним пулами на розвиток секретогенної дії -LTX. Показано, що внаслідок виснаження везикул протонофором FCCP (в середовищі без Са2+) або бафіломіцином А1 (в присутності та відсутності Са2+) відбувається зникнення або пригнічення першого швидкого (перші 2 хв) та значне посилення пізнішого етапу (на 5-10 хв) секреторної дії -LTX (як у низькій, так і у високій концентрації). Це свідчить про залучення різних механізмів вивільнення ГАМК на різних етапах розвитку процесу: екзоцитозу на першому етапі та витікання ГАМК із цитозолю - на другому.

  7. Вперше одержані прямі докази участі ГАМК-транспортера плазмалеми у вивільненні ГАМК під дією -LTX. Продемонстровано, що блокування транспорту ГАМК несубстратним інгібітором NO-711 пригнічує другий етап розвитку секретогенної дії токсину. Отже, саме на пізнішому етапі відповіді синаптосом відбувається залучення -латротоксином цитозольного пулу ГАМК, а її вихід із цитозолю відбувається (принаймні частково) шляхом оберненої роботи переносника ГАМК.

Loading...

 
 

Цікаве