WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Удосконалення транспортного обслуговування вантажовласників у транспортних вузлах (автореферат) - Реферат

Удосконалення транспортного обслуговування вантажовласників у транспортних вузлах (автореферат) - Реферат

Публікації. Результати досліджень опубліковані в 5 статтях у наукових фахових виданнях та 6 тезах доповідей у збірках наукових конференцій.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження виконані на щурах (самці вагою 100-120 г). У декапітованих тварин швидко вилучалися великі півкулі головного мозку. Синаптосоми виділяли з гомогенату великих півкуль шляхом диференційного центрифугування та центрифугування в градієнті фіколла за методом Котмана (Cotman, 1974). Фракцію синаптосом суспендували в стандартному сольовому розчині, що містив (мM): NaCl – 126, KCl – 5, MgCl2 – 1.4, NaH2PO4 – 1.0, HEPES – 20 (pH 7.4), d-глюкозу – 10, амінооксиоцтову кислоту (інгібітор ГАМК-трансамінази) – 0.1. Сольовий розчин насичували O2 перед використанням. Усі операції проводили при 0-40С. Концентрацію білка визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951) у модифікації Ларсона (Larson et al., 1986).

Синаптосоми (2 мг білка/мл) навантажували [3H]ГАМК у стандартному сольовому розчині, що містив 1 мМ кальцію. Синаптосоми, відмиті шляхом центрифугування від [3H]ГАМК, яка не захопилася, та від Са2+, суспендували в номінально безкальцієвому стандартному сольовому розчині. Препарат (1мг білка/мл) використовувався для досліджень одразу і не довше 4 год після виділення.

Кількість вивільненої [3H]ГАМК визначали в супернатантах і в SDS-розчинених осадах шляхом вимірювання радіоактивності у сцинтиляційній рідині AСS на лічильнику Delta 300 ("Tracor Analytic", США). Вміст [3H]ГАМК у супернатантах вира-жався у відсотках від загальної кількості мітки у синаптосомах. Вивільнення [3H]ГАМК із синаптосом, преінкубованих без стимулювальних агентів в Ca2+-вмісному або без-кальцієвому середовищі, приймалося за базальне вивільнення. Стимульоване вивіль-нення [3H]ГАМК обчислювали як різницю між кількістю [3H]ГАМК, що вивільняється під впливом стимулювальних агентів, і базальним вивільненням.

Для перемеалізації брали навантажені [3H]ГАМК синаптосоми протягом 2 год після навантаження. Синаптосоми, суспендовані у номінально безкальцієвому стан-дартному сольовому розчині з 2 мM АТФ, обробляли 20 мкг/мл дигітоніном протягом 5хв при 250С. Потім на препараті досліджували стимульоване вивільнення [3H]ГАМК.

Зміни трансмембранного потенціалу синаптосом реєстрували, вимірюючи флуоресценцію катіонного потенціалчутливого зонду родаміну 6G на спектрофлуориметрі Hitachi MPF-4 (Японія) у термостатованій кюветі при постійному перемішуванні. Довжини хвиль збудження і флуоресценції були 528 нм і 551 нм, відповідно.

Статистична обробка даних проводилась за загальновизнаними методами варіаційної статистики за допомогою ПК. Всі чисельні значення результатів досліджень наводились у вигляді середньоквадратичне відхилення (SEM). Після кожного результату наводиться значення кількості експериментів (n). Достовірність статистичних відмінностей для груп даних досліджень визначалася за допомогою Стьюдент тесту (t-тесту). Критерієм достовірності відмінностей було значення р  0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Для дослідження особливостей механізмів стимуляції α-латротоксином нейросекреції було обрано декілька експериментальних стратегій: в синаптосомах змінювали кількість нейромедіатора у везикульованому пулі або в цитозолі, або пригнічували екзоцитоз різними агентами, також комбінували ці підходи, і потім досліджували особливості дії α-LTХ за цих умов.

  1. Дія -LTX на синаптосоми з виснаженим цитозольним пулом [3H]ГАМК

В рамках першої серії дослідів нашим завданням було з'ясувати, чи визначає кількість ГАМК у цитозолі відповідь синаптосом на дію α-LTХ. Загальний підхід полягав у тому, щоб виснажити цитозольний пул [3H]ГАМК шляхом пермеалізації синаптосом або використовуючи конкурентні інгібітори ГАМК-транспортера (НК і 2,4-ДАМК), і після цього виміряти Ca2+-залежне і Ca2+-незалежне LTХ-стимульоване вивільнення [3H]ГАМК. Якщо джерелом медіатору є цитозоль, то логічно припустити, що виснаження цього пулу має спричинити відповідне послаблення виходу нейромедіатора.

В результаті проведених дослідів ми встановили, що для пермеалізованих дигітоніном синаптосом необхідна наявність екзогенного АТФ для підтримання протонного градієнту синаптичних везикул і здатності їх до екзоцитозу у відповідь на зростання [Са2+]i. Додавання α-LTХ до синаптосом, пермеалізованих у базкальцієвому буфері, спричиняє швидке вивільнення [3H]ГАМК, що є більшим за присутності АТФ, аніж за його відсутності. Вивільнення відбувається і у середовищі з ЕГТА, отже ефект токсину може розвиватися і за дуже низьких концентрацій Са2+.

Для того, щоб з'ясувати, чи за цих умов зв'язується α-LTХ специфічно з Са2+-незалежним рецептором, були проведені експерименти з конканаваліном А. Цей лектин практично не змінює здатність токсину приєднуватися до рецепторів, але пригнічує нейросекрецію, стимульовану α-LTХ. Преінкубація з ConА майже повністю інгібує здатність токсину вбудовуватися до плазматичної мембрани. Крім того, після зв'язування із мембранним рецептором α-LTХ піддається конформаційним змінам, яким і перешкоджає ConА (Khvotchev &Sudhof, 2000). В наших дослідах, коли синаптосоми перед пермеалізацією обробляли 5мкМ ConА, 1 нМ токсин за таких умов не викликав вивільнення [3H]ГАМК. Отже, можна зробити припущення, що нейросекреція, стимульована α-LTХ з пермеалізованих синаптосом у середовищі, вільному від Са2+, є результатом специфічного впливу токсину на процес екзоцитозу. Це узгоджується і з даними інших дослідників (Bittner&Holz, 2000).

Наступними були проведені досліди з конкурентними інгібіторами зворотного захоплення ГАМК. Отримані результати свідчать, що НК і 2,4-ДАМК ефективно виснажують цитозольний пул [3H]ГАМК. Після додавання до навантажених синаптосом цих агентів відбувається гетерообмін нейромедіатора з ними, внаслідок чого спостерігається значне зростання кількості позасинаптосомальної мітки.

Водночас, виснаження цитозольного пулу [3H]ГАМК має різні наслідки для дії - LTХ. За таких умов у механізмі дії субнаномолярної та наномолярної концентрацій токсину спостерігаються істотні відмінності. Після зменшення цитозольного пулу [3H]ГАМК секретогенний ефект 3нМ -LTХ (концентрація, що перевищує Кд токсин-рецепторного комплексу) був у 2 -3 рази слабшим за контроль. Причому результати таких дослідів були подібними, незалежно від наявності в середовищі Ca2+, а отже і від типу залученого рецептора токсину.

В той же час, із синаптосом з виснаженим цитозольним пулом [3H]ГАМК вивільнення, викликане 0.5 нМ токсином, було навіть трохи вищим за контроль. Це можна пояснити конкурентним блокуванням НК зворотного входу [3H]ГАМК. Результати цих експериментів були подібними, незалежно від наявності в середовищі Ca2+. Логічно було припустити, що у субнаномолярній концентрації (нижчій за Кд комплексу токсин-рецептор) -LTХ не викликає помітного виходу цитозольної ГАМК.

Таким чином, механізм вивільнення ГАМК, скоріш за все, не визначається наявністю чи відсутністю Са2+ в середовищі (а отже, і типом рецептора, до якого приєднується токсин). Експерименти вказували на можливість того, що під дією токсину ГАМК виходить із цитозолю. Варто було продовжити дослідження із застосуванням підходу, який би міг підтвердити та поглибити зроблені висновки.

2.Вплив -латротоксину на синаптосоми за умов модулювання процесу екзоцитозу синаптичних везикул інгібіторами протеїнфосфатаз

Відомо, що багато білків, які беруть участь у здійсненні процесу екзоцитозу, регулюються шляхом фосфорилювання-дефосфорилювання. Ми обробляли синаптосоми інгібіторами основних серинових/треонінових протеїнфосфатаз (ПФ) – 1, 2А і 2В, щоб порівняти, чи однаково потребують активності певних ПФ для своєї секретогенної дії 4-амінопіридин (стимулятор Са2+-залежного екзоцитозу) та -LTХ.

В наших експериментах 1мкM окадаєва кислота (інгібує ПФ 1 та 2А) помітно пригнічувала секретогенний ефект 2мM 4-амінопіридина. 1мкM циклоспорин А (інгібітор ПФ 2B), навпаки, посилював екзоцитоз, стимульований 4-амінопіридином. Отже, ПФ 1, 2А та 2В є важливими для цього процесу. Це узгоджується і з висновками інших дослідників (Baldwin et al., 2003). Як 1мкM ОК, так і 10мкM CsА посилювали стимулювальну дію -LTХ. Це свідчить про те, що механізми нейросекреції, викликаної токсином і 4-амінопіридином, мають певні відмінності.

Окремо варто зазначити, що по-перше, ефекти обох агентів на дію токсину були однаковими середовищах з Са2+ та без Ca2+. По-друге, чим нижчою була використана концентрація -LTХ, тим помітнішою була активація CsА нейросекреції, стимульованої -LTХ. Можливо, що у випадку високих концентрацій токсину зростав внесок процесу витікання ГАМК із цитозолю (нечутливе до дії інгібітора ПФ).

3. Дія -LTX за умов інгібування процесу екзоцитозу інгібітором ФІ 4-кінази феніларсен оксидом

Наступна серія експериментів була проведена на синаптосомах, в яких було пригнічено синтез фосфатидилінозитол-4,5-дифосфату, який є однією з молекул, важливих для здійснення екзоцитозу. Для цього був використаний інгібітор ФІ4-кінази (а зрештою, і процесу екзоцитозу) феніларсен оксид (ФАО). Завданням був детальний аналіз дії ФАО на вивільнення [3H]ГАМК, стимульоване деполяризацією 4-АП або різними концентраціями -LTХ.

ФАО майже повністю пригнічував нейросекрецію, стимульовану як деполяризацією 4-АП (тобто екзоцитоз), так і субнаномолярною концентрацією токсину. Це можна було розглядати, як ще одне підтвердження того, що основна дія низьких концентрацій токсину – стимуляція екзоцитозу. Чутливість до ФАО -LTХ-стимульованого екзоцитозу не залежала від наявності Са2+ в позаклітинному середовищі.

Loading...

 
 

Цікаве