WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Екологічні особливості антропно трансформованих рослинних угруповань (автореферат) - Реферат

Екологічні особливості антропно трансформованих рослинних угруповань (автореферат) - Реферат

Етиловий спирт вносили до кінцевої концентрації 0,3% на першу, 7-у та 10-у добу росту. Внесення спирту на більш пізніх етапах культивування не приводило до підвищення вмісту ергостерину та змін у швидкості споживання кисню (мал. 4).

Мал. 4. Інтенсивність дихання клітин культури Saccharomyces cerevisiae у процесі культивування (1) і після внесення етилового спирту до кінцевої концентрації 0,3% на першу добу (2), 7 добу (3) і 10 добу (4) росту (n=5)

У мікроорганізмів розрізняють дві основні фази розвитку культури: фазу росту – тропофазу і фазу спеціалізації клітин – ідіофазу. Протягом останньої фази розвиваються характерні для даного організму хімічні і морфологічні особливості, у тому числі і вторинний обмін. Тропофазні клітини мікроорганізмів і ембріональні клітини тваринних організмів і вищих рослин у багатьох відношеннях подібні один одному – їхній метаболізм добре збалансований і забезпечує максимальну швидкість синтезу метаболітів, необхідних для розмноження. На окремих прикладах було показано, що залежність вторинного обміну від фази є наслідком фазозалежного утворення ферментів, які синтезують вторинні сполуки [Лукнер М., 1979].

Оскільки 7 доба росту – це етап переходу від експоненціальної до стаціонарної фази росту культури, то при внесенні етилового спирту в середовище ще спостерігається незначний ефект. Однак на 10 добу культура знаходиться у стаціонарній фазі росту, вторинний метаболізм вже активований, і тому внесення етилового спирту не впливає на накопичення стеринів клітиною. Отже, ефект збільшення вмісту ергостерину в клітинах дріжджів залежить не тільки від концентрації етилового спирту в середовищі культивування, але і від характеристик метаболічної активності системи на момент впливу.

Таким чином, можна говорити про те, що на ранніх етапах синтезу доступність біосистем для ефективного регуляторного впливу з боку екзогенних факторів значно вища, ніж на більш пізніх етапах росту культури (у стаціонарній фазі).

Вміст ергостерину в клітинах дріжджів при використанні різних концентрацій іонів Са, температурних режимів культивування та етилового спирту. Синтез ергостерину – складний процес, регуляція якого може здійснюватися на різних етапах [Hand R.A.et al., 2003], отже, є підстави припустити, що спільна дія декількох індукторів синтезу ергостерину, які діють на різних етапах біосинтезу, здатна, забезпечити адитивний ефект щодо накопичення ергостерину в клітинах дріжджів. У зв'язку з цим становить інтерес дослідження ефективності спільної дії етилового спирту та іонів кальцію на стериноутворення в клітинах дріжджів. Такий підхід дозволить не тільки одержати максимальний ефект, але й вивчити можливі механізми дії етилового спирту та іонів кальцію на стериноутворення.

У першій серії експериментів вивчали вплив іонів Caна накопичення ергостерину, а також на фізіологічний стан культури дріжджів, який оцінювали за кількістю мертвих клітин, вмістом продуктів перекисного окислення ліпідів і інтенсивністю дихання клітин.

Внесення в середовище культивування CaCl до концентрації 0,1 мг/мл не приводило до достовірних змін досліджуваних показників: вміст ергостерину, кількість мертвих клітин, інтенсивність дихання культури і вміст у ній продуктів перекисного окислення ліпідів були на рівні контролю (табл. 3).

Таблиця 3

Вміст ергостерину, продуктів перекисного окислення ліпідів (визначених за МДА) і інтенсивність дихання суспензії клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiae на 14 добу росту культури при внесенні різних концентрацій CaCl у першу добу росту (n=5)

Концентрація

Са, мг/мл

Кількість мертвих клітин, %

Вміст ергостерину,

нмоль на 10клітин

Вміст МДА,

нмоль на мг білка

Інтенсивність дихання,

натомО/хв.10клітин

Контроль

1,00  0,05

14,40  0,35

0,072 0,005

15,6  1,4

0,1

1,00 0,03

15,27  0,35

0,074 0,009

16,1  2,5

0,5

0,90 0,02

18,15  0,77*

0,079 0,009

17,5  2,0

1,0

1,90 0,05*

12,70  0,45*

0,084 0,010

9,6  1,5 *

* - Р < 0,05 у порівнянні з контролем

При концентрації CaCl у середовищі 0,5 мг/мл накопичення ергостерину збільшувалося і перевищувало контроль на 26,2%. Вміст продуктів окислення ліпідів у культурі і кількість мертвих клітин залишалися на рівні контролю (табл. 3).

Вміст CaCl у середовищі в концентрації 1,0 мг/мл приводив до зменшення накопичення ергостерину клітинами дріжджів відносно контролю на 9,2%. Інтенсивність дихання культури клітин дріжджів також знижувалася на 24,3% відносно контролю. Кількість мертвих клітин зростала в 1,9 рази. Вміст продуктів перекисного окислення ліпідів у культурі істотно не змінювався (табл. 3).

Можна припустити, що збільшення накопичення ергостерину при внесенні іонів кальцію пов'язано з активацією специфічних ферментних систем і активністю мітохондрій, які мають вплив на кінцеві етапи стериногенеза.

У другій серії експериментів для вивчення спільного впливу на накопичення ергостерину іонів кальцію і етилового спирту використовували комбінацію оптимальних концентрацій: CaCl – 0,5 мг/мл, етилового спирту – 0,3%, 0,5% і 1,0% (кінцеві концентрації у середовищі). Вимір показників проводили на 10 і 14 добу росту культури дріжджів. Спільне внесення 1,0% етилового спирту й іонів кальцію в середовище культивування приводило до збільшення накопичення ергостерину клітинами дріжджів на 14 добу росту майже на 62%. При внесенні тільки іонів Са в концентрації 0,5 мг/мл у живильне середовище вміст ергостерину в клітинах дріжджів зростав на 26% у порівнянні з контролем, а при внесенні тільки етилового спирту – на 40% .

Відомо, що важливим фактором регуляції росту мікроорганізмів є температура, оскільки вона впливає на швидкість біосинтетичних процесів у клітинах і в підсумку – на склад синтезованих продуктів і швидкість росту мікроорганізмів [Феофилова Е.П. и др., 2000]. Було встановлено, що мікроорганізми мають два температурних оптимуми: один для росту, інший – для вторинного метаболізму [Квасников Е.И. и др., 1991].

Оптимальною температурою культивування клітин дріжджів для накопичення ергостерину є 25°С: на 24 добу вміст ергостерину становив біля 20 нмолей на 10клітин. При культивуванні дріжджів при 30°С кількість ергостерину незначно зростала (мал. 5), однак кількість мертвих клітин у культурі збільшувалась .

Внесення іонів кальцію при рості культури дріжджів при неоптимальному для накопичення стеринів режимі вело до збільшення накопичення ергостерину клітинами дріжджів тільки у випадку росту при температурі 20°С. При культивуванні клітин дріжджів при температурі 35°С наявність іонів кальцію в середовищі не тільки не призводила до підвищення вмісту ергостерину, а навіть знижувала його на 12%.

Мал. 5. Вміст ергостерину в клітинах дріжджів Saccharomyces cerevisiae за умов росту при різних температурних режимах (n=10)

Розробка засобів руйнування клітинних стінок дріжджів: видалення клітинних стінок дріжджів ферментним комплексом Chaetomium globossum

Клітини дріжджів широко використовуються як модельний об'єкт генетичних досліджень і як продуценти в сучасних біотехнологіях: використовуючи їх високу модифікаційну мінливість, можна одержувати широкий спектр амінокислот, вітамінів, ферментів. Однак вирішення цих задач ускладнено через ригідність клітинної стінки дріжджів, на яку припадає до 30% сухої маси клітини [Kollar R. et al., 1995]. Найбільш ефективним способом видалення клітинної стінки на даний час є ферментативний гідроліз її компонентів ферментами однієї субстратної специфічності або такими, що руйнують різні компоненти клітинних стінок одночасно. Одними з продуцентів гідролітичних ферментів є міцеліальні гриби, екзоферменти яких мають високу активність відносно компонентів клітинної стінки дріжджів [Hashem A.M. et al, 2001].

Задачами даної частини роботи були: підбір продуцентів ферментативних комплексів, що мають здатність гідролізувати клітинні стінки дріжджів, і оцінка ступеня гідролітичного розщеплення внутрішньоклітинних компонентів клітин культури дріжджів протягом їх інкубації з гідролітичними екзоферментами грибів.

У результаті попереднього скринінгу з Chaetomium globossumKunze:Fr., Trichoderma viridePers.et Harz., Bipolaris sorokiniana Sacc.et Shoem., та Fusarium sр. нами був відібраний міцеліальний гриб Ch. globossumKunze, про ступінь руйнування клітин дріжджів ферментним комплексом цього гриба свідчить проведений мікроскопічний аналіз суспензії дріжджових клітин (мал. 6).

Loading...

 
 

Цікаве