WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Екологічні особливості антропно трансформованих рослинних угруповань (автореферат) - Реферат

Екологічні особливості антропно трансформованих рослинних угруповань (автореферат) - Реферат

При підрахунку кількості клітин було виявлено, що популяційно-"молода" і популяційно-"стара" культури різнілися за кількістю живих і мертвих клітин (мал. 2). Кількість мертвих клітин у популяційно-"молодій" культурі до 14 доби становила близько 2%, а у популяційно-"старій" – 5%. На 21 добу у популяційно-"молодій" культурі було близько 8% мертвих клітин, а у популяційно-"старій" – 13 % (мал. 1).

Кількість живих клітин у 1 мл популяційно-"молодої" культури на 14 добу росту була на 16%, а до 21 – на 15% більша, ніж у популяційно-"старій" культури дріжджів. Було виявлено, що діаметр клітин у популяційно-"молодій" культурі був на 9 – 10 % більшим за діаметр клітин культури, що пройшла 75 пасажів (мал. 1).

Мал. 1. Кількість живих і мертвих клітин у популяційно-"молодій" (а) і популяційно-"старій" (б) культурах дріжджів Saccharomyces cerevisiae (n=60)

Відомо, що захисні та репараційні системи клітин індукуються ушкодженнями чи прямою реакцією на стрес і активуються для обмеження ушкоджень. При старінні накопичені ушкодження насамперед викликають зниження рівня активності та дезорганізацію захисних систем [Кордюм Е.Л., 2003]. Старіння веде до зменшення інтенсивності та стресіндуцибельності енергетичного метаболізму, нормальний рівень яких є необхідною вимогою для ефективної відповіді клітин на стрес і виживання в стресорних умовах [Toussaint O. et al.,1998]. У зв'язку з цим ми порівнювали стійкість популяційно-"молодої" і популяційно-"старої" культури до теплового та осмотичного стресу.

Мал. 2. Кількість мертвих клітин у 14-добовій популяційно-"молодій" (1) і популяційно-"старій" (2) культурах клітин Saccharomyces cerevisiae після теплового шоку (45° С) (n=10)

Було виявлено, що популяційно-"молода" культура була більш стійкою до температурного впливу (мал. 2). У випадку осмотичного шоку 15- і 30- хвилинні експозиції призводили до збільшення кількості мертвих клітин в обох культурах майже в 2 рази, істотних розходжень між ними не спостерігалося. Через годину від початку впливу кількість мертвих клітин у популяційно-"старій" культурі становила майже 62%, що було в 1,6 разів більше, ніж у популяційно-"молодій". Таким чином, популяційно-"стара" культура була менш стійкою до стресорних впливів, що виявлялося в значно більшій загибелі її клітин при температурному й осмотичному стресі у порівнянні з популяційно-"молодою" культурою.

Зниження накопичення ергостерину в популяційно-"старій" культурі можна пояснити зменшенням діаметра клітин і збільшенням кількості мертвих клітин у культурі при тривалому й інтенсивному культивуванні. Однак відомо, що для росту і розмноження клітини дріжджів потребують певного вмісту ергостерину [Михайлова Н.П. и др., 1987], тому можливий і зворотний механізм, коли зміна у метаболізмі ергостерину і, як наслідок, зниження його вмісту в культурі клітин, веде до морфологічних змін і зменшення загальної кількості клітин у культурі. Відповідна реакція на індукцію стериноутворення, оцінювана за вмістом ергостерину, була менш вираженою у популяційно-"старій" культурі, отже, ефективність індукції залежить від активності метаболічної системи об'єкта на момент впливу і знижується при збільшенні популяційного віку культури.

У подальших експериментах ми використовували культуру клітин дріжджів, що пройшла не більше 50 пасажів.

Вплив концентрації і терміну внесення джерела вуглецю на накопичення ергостерину в клітинах дріжджів. Відповідно до сучасних уявлень, біосинтез стеринів і, зокрема, ергостерину, у дріжджів регулюється проміжними продуктами вуглеводного обміну і залежить, в основному, від штаму дріжджів, складу живильного середовища і умов культивування [Синицкая Н.А., 1993].

Нами була поставлена задача вивчення активності вторинного метаболізму, яку оцінювали за індукцією накопичення ергостерину в культурі клітин S. cerevisiae, у залежності від концентрації і терміну внесення джерела вуглецю у середовище культивування дріжджів.

Як джерело вуглецю використовували різні концентрації пивного сусла (при наявності і відсутності 1% глюкози у середовищі) і етилового спирту в першу добу росту, а також низькі концентрації етилового спирту на початку експоненціальної і на різних етапах стаціонарної фази росту культури клітин дріжджів.

Мал. 3. Вплив концентрації пивного сусла в середовищі культивування на вміст ергостерину й інтенсивність дихання клітин культури Saccharomyces cerevisiae (21-а доба росту) (n=10)

Оптимальна концентрація пивного сусла для накопичення ергостерину в культурі клітин дріжджів та максимальній активності метаболізму, яку оцінювали за інтегральним показником інтенсивності дихання суспензії дріжджів, становила 15-35%. Подальше збільшення вмісту сусла призводило до зниження накопичення ергостерину і падіння інтенсивності дихання в культурі дріжджів (мал. 3).

При використуванні комбінації 1% глюкози з 25, 50, 75 або 100%-им пивним суслом, максимальний вміст ергостерину виявлявся при рості культури дріжджів на 1% глюкозі і 25% пивному суслі – 28, 3 нмоль на 10клітин, що відповідало вмісту ергостерину при рості дріжджів на 25%-35% пивному суслі без глюкози. Подальше збільшення концентрації пивного сусла у середовищі призводило до зниження накопичення ергостерину й інтенсивності дихання в культурі дріжджів. Таким чином, спостерігалася дозова залежність, яка виражалася в індукції стериноутворення при рості на середовищі, що містить низькі концентрації джерела вуглецю, і інгібування накопичення ергостерину високими концентраціями вуглецю. Пригнічення утворення вторинних сполук надлишком живильних речовин, зокрема, глюкозою, а також іншими легко засвоюваними джерелами вуглецю, фосфатом і іншими, являє собою загальне явище в культурах мікроорганізмів .

Ріст на різних середовищах може приводити до змін у вторинному метаболізмі, і, як наслідок, до варіацій у накопиченні вторинних метаболітів у клітинах дріжджів, що, у свою чергу, може виявлятися в різній стійкості культур до стресорних впливів. При порівнянні стійкості культур, що виросли на середовищах з різним вмістом пивного сусла (25%, 50%, 75%, 100%) і 1% глюкозою до теплового й осмотичного шоку була виявлена тенденція до збільшення загибелі клітин у культурах, що росли на 75% і 100% пивному суслі і постійному вмісті глюкози (1%).

Різні концентрації джерела харчування, імовірно, діють на різних етапах біосинтезу ергостерину: при внесенні низьких концентрацій пивного сусла відбувається включення вуглецю до ацетату і з ним – у подальший біосинтез стеринів, тобто ефект має місце на початкових етапах синтезу. Збільшення концентрації джерел вуглецю в середовищі культивування призводить до катаболічної репресії [Hongay C. et al., 2002] і, як наслідок, до інгібування дихання і блокуванню кінцевих стадій синтезу ергостерину зі сквалену. Таким чином, внесення різних концентрацій джерел вуглецю у середовище може справляти регуляторний вплив на різних етапах біосинтезу ергостерину.

Оскільки синтез стеринів безпосередньо не пов'язаний з ростом і розмноженням клітин, то довгий час дослідження були спрямовані на пошуки таких субстратів, які були б найбільш ефективними відносно стериноутворення. Ефективність різних джерел вуглецю щодо накопичення стеринів залежить від здатності вуглеводів проникати через клітинну стінку дріжджів. Найбільший приріст ергостерину спостерігався при використанні таких джерел вуглецю, як глюкоза, сахароза та етиловий спирт [Ляпунова Т.С., 1966]. Відомо, що етиловий спирт істотно впливає на динаміку росту культури клітин і метаболізм ліпідів у дріжджів, водоростей та інших одноклітинних організмів [Божков А.И. та ін., 2002; Zhang M. et al., 2000].

Внесення різних концентрацій етилового спирту в культуру дріжджів приводило до різних ефектів: так, при концентрації від 0,3% до 0,9% спостерігалося збільшення вмісту ергостерину в культурі клітин без значної зміни життєздатності клітин. Збільшення вмісту спирту в середовищі до кінцевої концентрації 1,2% – 2,1% супроводжувалося більш значним приростом ергостерину, однак кількість мертвих клітин при цьому також різко зростала. Подальше збільшення концентрації спирту в середовищі культивування до 2,4% – 3,0% спричиняло зниження накопичення ергостерину клітинами дріжджів відносно максимального приросту. Відсоток мертвих клітин при цьому зростав у декілька разів. Це свідчить про високу чутливість клітин дріжджів навіть до невеликих змін концентрації внесеного етилового спирту.

Вивчення ефективності регуляторної дії однакових факторів при їх впливі на різні етапи онтогенезу є загальбіологічною задачею. Відомо, що додаткове внесення кисню протягом стаціонарної фази росту культури дріжджів призводило до ряду змін у метаболізмі, в тому числі й до збільшення накопичення стеринів [Rosenfeld E. et al., 2003]. Зміни у стериноутворенні при внесенні спирту на різних стадіях росту культури дріжджів раніше не вивчалися. Дослідження цього питання становить інтерес для характеристики метаболізму клітин дріжджів у процесі росту культури.

Loading...

 
 

Цікаве