WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Екологічні особливості антропно трансформованих рослинних угруповань (автореферат) - Реферат

Екологічні особливості антропно трансформованих рослинних угруповань (автореферат) - Реферат

  • одержувати харчові добавки, що мають високу харчову цінність.

  • одержувати протопласти дріжджів, необхідні для сучасних біотехнологій і молекулярно-генетичних досліджень.

Підбір умов культивування зможе забезпечити стабільне і більш інтенсивне (в 1,5 – 2 рази у порівнянні з контролем) накопичення ергостерину клітинами дріжджів, дозволить одержати харчову і кормову добавку, збагачену попередником вітаміну Д, що необхідно для профілактики рахіту у дітей і молодняку тварин.

Результати цієї роботи були використані у навчальному процесі біологічного факультету Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна і кафедри біотехнології Харківського національного політехнічного університету "Харківський політехничний інститут", а також при утилізації залишкових пивних дріжджів на ОАТ"Пивзавод "Рогань".

Особистий внесок здобувача. Самостійно була підібрана і проаналізована література за темою дисертації, здійснена постановка експериментів, вибір досліджуваних показників і статистична обробка отриманих результатів. Усі експерименти проведені самостійно, крім експериментів з руйнування клітинних стінок дріжджів екзометаболітами Chaetomium globossum Kunze, які були виконані разом з В.І. Облак. Аналіз і інтерпретація отриманих результатів проведені разом з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати й основні положення роботи доповідалися на конференції "Научные исследования в наукоградах Московской области: От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2002), конференції "Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии" (Томськ, 2004), VII Міжнародній науково-практичній конференції "Наука і освіта`2004" (Дніпропетровськ, 2004), VI Міжнародному симпозіумі "Біологічні механізми старіння" (Харків, 2004) і наукових семінарах у НДІ біології Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна.

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковані 3 статті і 4 тез доповідей.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу і розділів: огляд літератури, матеріали і методи дослідження, результати власних досліджень та їх обговорення (5 розділів), узагальнення отриманих результатів і висновків, а також списку цитованої літератури (260 літературних джерел, з яких 122 іноземних авторів). Робота викладена на 153 сторінках друкованого тексту і містить 15 таблиць і 18 малюнків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Огляд складається з 4-х підрозділів, у яких наведено аналіз наукової літератури щодо метаболізму ергостерину: механізмів синтезу і його регуляції, ролі ергостерину в клітинах дріжджів, а також залежності накопичення ергостерину в клітинах дріжджів середовища культивування. Розібрані питання будови клітинної стінки дріжджів і методи її руйнування. В огляді обґрунтовано вибір напрямків досліджень і наведені способи вирішення задач, що поставлені у роботі.

Матеріали і методи дослідження. Дослідження проводили на дикому штамі пивних дріжджів Saccharomyces cerevisiae.

Динаміку росту культури визначали за кількістю клітин, яку рахували загальнопринятим методом у камері Горяєва, а також по зміні оптичної щільністі при довжині хвилі 550 нм на спектрофотометрі СФ-46 ("ЛОМО", Росія). Нативність плазматичної мембрани клітин дріжджів оцінювали за допомогою фарбування барвником 0,8% трипановим синім [Seglen P.O., 1976] і виражали у відсотках від загальної кількості клітин. Діаметр клітини вимірювали, використовуючи мікроскоп МБІ-6 з окуляр-мікрометром. Екстракцію стеринів із клітин дріжджів здійснювали за методом Бревика і Оводса в модифікації Вудса [Woods R.A., 1971]. Визначення вмісту ергостерину проводили за допомогою двопроменевої спектрофотометрії при довжині хвилі 200-310 нм на спектрофотометрі Specord UV VIS "Carl Ziess Jena" (Німеччина), максимум поглинання при 281 нм [Яхимович Р.И., 1978], використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції 11500 М-1 см-1 [Huber W., 1945], а також за методом тонкошарової хроматографії [Хиггинс Д.А., 1990] і виражали у нмоль на 10клітин. Інтегральну активність метаболізму клітин дріжджів оцінювали за інтенсивністю ендогенного дихання клітин [Аливердиева Д.А., 2001,Рихванов Е.Г., 2001], яку визначали полярографічно за швидкістю споживання кисню з використанням закритого платинового електроду Кларка [Зеленский М.И., 1986] і виражали у натом О/ хв. на 10клітин. Інтенсивність вільно-радикального ушкодження оцінювали за вмістом ТБК-активних продуктів перекисного окислення ліпідів у суспензії дріжджів і виражали у нмоль малонового діальдегіду на мг білку. Вміст нуклеїнових кислот визначали після фракціонування за Шмідтом і Тангаузером з наступною спектрофотометрією за методом Спіріна [Спирин А.С., 1958] при довжинах хвиль 260, 270, 290 нм і виражали у мкг на 10клітин [Сокурова Е.Н., 1973]. Вміст білка досліджували за методом Лоурі в модифікації Міллера [Miller G.L., 1959]. Як стресорні чинники були обрані температурний і осмотичний шок. Тепловому шоку культуру дріжджів піддавали у водяному термостаті з температурою 45 ˚С. Експозиція становила 15, 30 і 60 хвилин [Рихванов Е.Г. и др., 2001]. Для вивчення стійкості клітин дріжджів до осмотичного шоку в культуру дріжджів вносили NaCl до кінцевої концентрації 1,3 М [Albertyn J. et al., 1994]. Експозиція становила 15, 30 і 60 хвилин. Стійкість культур дріжджів оцінювали за кількістю мертвих клітин, пофарбованих барвником трипановим синім. Продуцентами ферментного комплексу були міцеліальні гриби Chaetomium globossumKunze:Fr., Trichoderma viridePers.et Harz., Bipolaris sorokiniana Sacc.et Shoem., та Fusarium sp. Статистичну обробку нормально розподілених даних проводили за допомогою методу Стьюдента-Фішера [Лакин Г.Ф., 1990]. Рангову кореляцію обчислювали за Спірманом.

Основні результати та їх обговорення

Зміна деяких морфофункціональних характеристик у процесі тривалого культивування дріжджів. Старіння клітинних культур внаслідок численних пересаджень, яке веде за собою зміну вихідних характеристик – це загальнобіологічна проблема, що стосується як культур мікроорганізмів, так і рослинних та тваринних клітин. Разом з тим, у наукових дослідженнях і на виробництві часто застосовується тривале й інтенсивне пасирування культур, що може вести до морфофункціональних зрушень у клітинах, обумовлених накопичуванням різних генетичних модифікацій [Божков А.И. и др., 2000; Голтвянский А.В., 2004], внаслідок чого культура клітин втрачає свої вихідні характеристики. Дослідження інтенсивності вторинного метаболізму, про яке судили за вмістом ергостерину в культурі дріжджів, при тривалому інтенсивному пасируванні раніше не проводилися.

Метою даного етапу досліджень було визначення вмісту ергостерину в процесі тривалого культивування дріжджів Saccharomyces cerevisiae (10–15 пасажів – популяційно-"молода" культура і 70-75 пасажів – популяційно-"стара" культура) і деяких морфофункціональних характеристик клітин дріжджів. Пересадження культури проводили кожні 14–16 днів, тобто вік популяційно-"молодої" культури становив 5–6 місяців, а популяційно-"старої" культури – 3-3,5 роки. Виходячи з цього терміни популяційно-"молода" і популяційно-"стара" культура у даному випадку відбивають саме популяційний вік культури дріжджів.

До 14-ї доби росту вміст ергостерину був порівняно невисоким в обох культурах і істотних розходжень виявлено не було. На 21 добу вміст ергостерину в популяційно-"молодій" культурі був на 23% вище, ніж у "старій" (табл. 1).

Таблиця 1

Вміст ергостерину в клітинах популяційно-"молодої" і популяційно-"старої" культури дріжджів Saccharomyces cerevisiae у контролі та при внесенні у середовище 0,3 % етилового спирту в першу добу культивування (n=20) (середовище росту: 1% глюкоза, 0,5% сусло, 0,5% дріжджовий екстракт)

Кількість

пасажів

Тривалість

культивування, діб

Вміст ергостерину, нмоль на 10клітин

контроль

0,3% етиловий спирт

10 – 15

14

12,6 0,7

14,6 0,9

21

16,1 0,7

21,9 0,7

70 – 75

14

11,5 0,9

13,4 0,8

21

12,3 0,6*

14,8 0,9*

* - Р < 0,05 у порівнянні з відповідною популяційно-"молодою" культурою

Відповідна реакція на індукцію стериноутворення внесенням 0,3% етилового спирту, яку оцінювали за зміною вмісту ергостерину, спостерігалася в обох культурах. Внесення спирту приводило до збільшення вмісту ергостерину в популяційно-"молодій" культурі на 14 добу росту на 13,7%, а на 21 добу – на 26% у порівнянні з відповідним контролем. У "старій" культурі вміст ергостерину був відповідно на 23% і 47% нижче, ніж у "молодій" культурі (табл. 1).

Loading...

 
 

Цікаве