WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Віддалені наслідки перенесених дифтерійних міокардитів (ранніх і пізніх) - Реферат

Віддалені наслідки перенесених дифтерійних міокардитів (ранніх і пізніх) - Реферат

Дисертаційна робота присвячена дослідженню основних етапів асиміляції С2-сполук у Аcinetobacter sp. В-7005, виявленню „вузьких" місць С2-метаболізму і розробці підходів до їхнього усунення з метою вдосконалення процесу одержання мікробного екзополісахариду етаполану.

У клітинах штаму Acinetobacter sp. В-7005, вирощеного на етанолі, визначено активність ключових ферментів С2-метаболізму, циклу трикарбонових кислот, а також анаплеротичних і деяких біосинтетичних шляхів.

Показано, що „вузьким" місцем метаболізму етанолу у Acinetobacter sp. В-7005 є асиміляція ацетату: реакція, що каталізується ацетил-КоА-синтетазою є швидкість-лімітувальною. Встановлено, що інгібіторами ацетил-КоА-синтетази є іони натрію, НАДН і НАДФН, а активаторами – катіони калію й магнію. Показано можливість усунення лімітування С2-метаболізму у Acinetobacter sp. В-7005 при внесенні в середовище з етанолом екзогенного ацетату. На основі досліджень регуляції С2-метаболізму встановлено умови культивування бактерій, що дають змогу підвищити в 3 рази активність ацетил-КоА-синтетази.

За таких умов синтезується високоацильований етаполан зі ступенем ацилювання 3 – 15%. Середня молекулярна маса полісахариду становить 1,5 млн і не змінюється в процесі виділення й очистки препарату. Підвищений вміст жирних кислот і висока молекулярна маса етаполану зумовлюють покращення реологічних властивостей його розчинів, що визначають практичну значущість цього ЕПС.

Ключові слова: метаболізм етанолу, регуляція С2-метаболізму, ацетил-КоА-синтетаза, екзополісахариди, біосинтез, фізико-хімічні властивості.

АННОТАЦИЯ

Корж Ю.В. Регуляция С2-метаболизма у Аcinetobacter sp. В-7005 – продуцента микробного экзополисахарида этаполана. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена изучению основных этапов ассимиляции С2-соединений у Acinetobacter sp. В-7005, выявлению узких мест С2-метаболизма и разработке подходов к их устранению с целью усовершенствования процесса получения микробного полисахарида этаполана.

Установлено, что окисление этанола до ацетальдегида у бактерий осуществляется НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназой с оптимумом рН 9,0. Акцепторами электронов в ацетальдегиддегидрогеназной реакции являются НАД+ и НАДФ+, оптимум рН 9,0 . Вовлечение ацетата в метаболизм у Acinetobacter sp. В-7005 происходит при участии ацетил-КоА-синтетазы, которая акцептирует коензим А с образованием ацетил-КоА. Анаплеротической последовательностью реакций, которые восполняют пул С4-дикарбонових кислот в клетках штамма, является глиоксилатный цикл, о чем свидетельствует наличие у бактерий изоцитратлиазы и малатсинтазы. Несмотря на наличие глиоксилатного цикла у Acinetobacter sp. В-7005 функционирует полный цикл трикарбонових кислот, который выполняет преимущественно биосинтетическую роль. При росте бактерий на этаноле образование пирувата происходит в оксалоацетатдекарбоксилазной реакции, а синтез фосфоенолпирувата (ФЕП) обеспечивается двумя ключевыми ферментами глюконеогенеза - ФЕП-карбоксикиназой и ФЕП-синтетазой, соотношение которых изменяется при переходе бактерий из экспоненциальной в стационарную фазу роста.

Показано, что „узким" местом метаболизма этанола у Acinetobacter sp. В-7005 является ассимиляция ацетата, о чем свидетельствовало ингибироваие окисления ацетата интактными клетками и активности ацетил-КоА-синтетазы в бесклеточном экстракте ионами натрия, а также лимитирование С2-метаболизма коензимом А. Установлено, что ингибиторами ацетил-КоА-синтетазы являются ионы натрия, а также интермедиаты окисления этанола и ацетальдегида - НАДН и НАДФН. Активаторами фермента являются катионы калия и магния. Снижение нчальной концентрации этанола в среде с 1,0 до 0,5 % (с последующим внесением 0,5 % этанола в середине экспоненциальной фазы роста бактерий), отсутствие соединений натрия в среде культивирования и наличие 100 мМ К+ дало возможность обеспечить практически одинаковую скорость окисления этанола, ацетальдегида и ацетата в интактных клетках бактерий, в три раза повысить активность ацетил-КоА-синтетазы в бесклеточном экстракте и реализовать биосинтез этаполана на практически незабуференной среде. Получение аналогичного результата при начальной концентрации этанола 1,0 % обеспечивалось повышением содержания витамина В5 в среде до 0,0012 % и концентрации Mg2+ до 5 мМ (при условии отсутствия солей натрия и наличии 100 мМ К+ в среде культивирования).

Показана возможность устранения лимитирования С2-метаболизма у Acinetobacter sp. В-7005 при внесении в среду с этанолом 0,1 % экзогенного ацетата при получении инокулята и биосинтезе ЭПС, что дало возможность осуществить без снижения показателей процесс синтеза этаполана на незабуференной среде, в которой общее количество солей снижено до 2,95 г/л.

В таких условиях синтезируется высокоацилированный этаполан со степенью ацилирования 3 – 15 %. Средняя молекулярная масса полисахарида составляет 1,5 млн и не изменяется в процессе выделения и очистки препарата. Повышенное содержание жирных кислот и высокая молекулярная масса этаполана обуславливают увеличение вязкости его растворов в присутствии одновалентных катионов и в системе Cu2+-глицин.

Установлено, что независимо от условий культивирования продуцента (содержание минеральных компонентов, соотношение С/N и молярность буфера в среде), нативные ЭПС характеризовались практически одинаковым содержанием углеводов и пировиноградной кислоты, однако отличались по количеству уроновых и жирных кислот, минеральных компонентов, а также содержанием ацилированного компонента.

Таким образом, на основании исследований особенностей энергетического и конструктивного метаболизма у штаммаAcinetobacter sp. В-7005 и В-7005 (1НГ) определены механизмы регуляции С2-метаболизма, что позволило разработать новый способ получения этаполана на незабуференной среде минимального состава. Этаполан, синтезованный в таких условиях, характеризовался необходимыми для практического использования реологическими свойствами.

Ключевые слова: метаболизм этанола, регуляция С2-метаболизма, ацетил-КоА-синтетаза, экзополисахариды, биосинтез, физико-химические свойства.

SUMMARY

Korzh J.V. Regulation of C2-metabolism in an Аcinetobacter sp. В-7005producer of microbial exopolysaccharide ethapolan. – Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.07 – microbiology. – The Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciense of Ukraine, Kiev, 2005.

The thesis is devoted to study of the basic stages of С2-compounds assimilation in Аcinetobacter sp. В-7005, to reveal „bottleneck" of С2-metabolism and to develop of approaches to their removal to improve process of microbial exopolysaccharide (EPS) ethapolan synthesis.

The ethanol-grown cells of Acinetobacter sp. В-7005 were analyzed for the activity of С2-metabolism key enzymes, tricarboxylic acids cycle, anaplerotic and some biosynthetic pathways enzymes.

Ethanol metabolism in Acinetobacter sp. В-7005 is limited by the rate of acetate assimilation in a reaction catalyzed by acetyl-CoA-synthetase, was shown. Effects of ions (sodium, potassium and magnesium), intermediates of ethanol and acetaldehyde oxidation (NADH and NADPH) on this enzyme were studied (sodium, NADH and NADPH inhibited acetyl-CoA-synthetase; potassium and magnesium acted enzyme activators). The exogenic acetate addition into ethanol containing medium abolished limitation of С2-metabolism in Acinetobacter sp. В-7005.

Basing on the investigations of С2-metabolism regulation the cultivation conditions were developed which allowed to increase the acetyl-CoA-synthetase activity in Acinetobacter sp. В-7005.

Ethapolan synthesized under these conditions was characterized by high level of acylation (3 - 15%). Molecular mass of this polysaccharide was 1,5 million and was not changed during purification. Improved reological properties of ethapolan were associated with high molecular mass and increasing fatty acids content.

Key words: metabolism of ethanol, regulation of С2-metabolism, acetyl-CoA-synthetase, exopolysaccharides, biosynthesis, physical and chemical properties.

Loading...

 
 

Цікаве