WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Віддалені наслідки перенесених дифтерійних міокардитів (ранніх і пізніх) - Реферат

Віддалені наслідки перенесених дифтерійних міокардитів (ранніх і пізніх) - Реферат

Публікації. За темою дисертації опубліковано 19 наукових праць, із них – 5 статті у фахових виданнях та 13 тез доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 152 сторінках машинописного тексту і складається із таких структурних частин: „Вступ", „Огляд літератури" (2 розділи), „Результати досліджень" (5 розділів), „Обговорення", „Висновки", „Список використаних джерел", який містить 218 посилання (з них 146 іноземних авторів). Робота містить 30 таблиць та 10 рисунків.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Розділ 1. Етаполан – екзополісахарид мультифункціонального призначення. Представлено характеристику мікробного ЕПС етаполану і штаму- продуцента. Проведено аналіз розроблених раніше шляхів інтенсифікації синтезу етаполану і технологій одержання цього ЕПС на різних вуглецевих субстратах (у тому числі на суміші ростових С2-С6-субстратів), а також розглянуто галузі практичного використання етаполану.

Розділ 2. Метаболізм С2-сполук у гетеротрофних мікроорганізмів. Наведено основні шляхи катаболізму С2-сполук, анаплеротичні реакції та особливості конструктивного метаболізму при рості гетеротрофів на С2-субстратах, а також проаналізовано відомі підходи до регуляції метаболізму у мікроорганізмів.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Розділ 3. Матеріали та методи досліджень

Характеристика використаних у роботі бактерій. Основним об'єктом досліджень був штам Acinetobacter sp. В-7005 – продуцент комплексного екзополісахаридного препарату етаполану (Гринберг и др., 1992), а також мутантний штам Acinetobacter sp. В-7005 (1НГ), що не утворює ЕПС, який був одержаний з вихідного за допомогою нітрозогуанідинового мутагенезу (Пирог и др., 2000).

Культивування бактерій. Культивування бактерій здійснювали в колбах на качалці (220 об/хв) при 30С, рН 6,8-7,0 впродовж 16-120 год на рідких мінеральних середовищах такого складу (г/л). Середовище 1: KH2PO4 - 6,8; NaOH – 0,9; NaCl - 1,05; NH4NO3 – 0,6; MgSO4  7H2O – 0,4; CaCl2  2H2O – 0,1; FeSO4 7H2O – 0,01. Середовище 2: KH2PO4 - 6,8; КOH - 1,8; КCl - 1,4; NH4NO3 – 0,6; MgSO4  7H2O – 0,4; CaCl2  2H2O – 0,1; FeSO4 7H2O – 0,01. Середовище 3: KH2PO4 – 3,4; КOH – 0,9; NH4NO3 – 0,3; MgSO4  7H2O – 0,4; CaCl2  2H2O – 0,1; FeSO4 7H2O – 0,01. Середовище 4: KH2PO4 – 3,4; КOH – 0,9; КCl - 4,4; NH4NO3 – 0,6; MgSO4  7H2O – 0,4; CaCl2  2H2O – 0,1; FeSO4 7H2O – 0,01. Середовище 5: KH2PO4 – 1,7; КOH – 0,45; NH4NO3 – 0,3; MgSO4  7H2O – 0,4; CaCl2  2H2O – 0,1; FeSO4 7H2O – 0,01. Середовище 6: KH2PO4 – 2,0; КOH – 0,55; КCl – 5,6; NH4NO3 – 0,6; MgSO4  7H2O – 0,4; CaCl2  2H2O – 0,1; FeSO4 7H2O – 0,01. Середовища різнилися між собою молярністю фосфатного буферу, загальною кількістю солей, наявністю Nа+, концентрацією одновалентних катіонів. Так, молярність буферу становила (М): середовища 1 і 2 – 0,05; 3 і 4 – 0,025; 5 і 6 – 0,0125. У середовища додатково вносили 0,5 % (за об'ємом) дріжджового автолізату та 0-0,0012 % пантотенату кальцію (вітамін В5). Штами В-7005 і В-7005 (1НГ) є ауксотрофами за цим вітаміном.

Як посівний матеріал використовували добову культуру, вирощену на МПА або змішаному агаризованому середовищі (МПА та сусло-агар у співвідношенні 1:1), а також культуру з експоненційної фази росту (16-24 год), вирощену на мінеральних середовищах 1ч6 з різними джерелами вуглецю. Джерелом вуглецю та енергії при одержанні посівного матеріалу і біосинтезі ЕПС були: а) 0,5 % етанолу (за об'ємом); б) 1 % етанолу (за об'ємом) за наявності або відсутності ацетату калію (0,1 % або 0,01 %); в) 1 % етанолу (за об'ємом) у присутності фумарату калію (0,2 %); г) 1,6 % ацетату калію. Кількість посівного матеріалу становила 5 % від об'єму середовища.

При дослідженні впливу екзогенного ацетату калію на ріст Acinetobacter sp. В-7005 (1НГ) культивування бактерій здійснювали на середовищі 2 з 1 % етанолу до середини експоненційної фази росту (16-18 год), після чого вносили ацетат калію (0-48 мМ).

Концентрацію біомаси визначали за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу у відповідності з калібрувальним графіком. Кількість синтезованих полісахаридів встановлювали ваговим методом (Williams, Wimpenny, 1978) та за концентрацією вуглеводів, що визначались колориметричним методом за реакцією з фенолом і сірчаною кислотою (Dubois et al. 1956). ЕПС-синтезувальну здатність визначали як відношення кількості синтезованих ЕПС до біомаси та виражали в г ЕПС/г біомаси.

Вміст ацетату в культуральній рідині визначали ензиматично за допомогою ацетаткінази (Криштаб, Соколов, 1985). Наявність ацетальдегіду встановлювали за реакцією з нітропрусидом натрію та піперідином (Файгль, 1962). Концентрацію етанолу визначали методом газорідинної хроматографії.

Константу Міхаеліса (Км) визначали графічно методом подвійних обернених величин Лайнуівера-Берка (Диксон, Уэбб, 1980).

Аналіз активності ферментів С2-метаболізму. Визначення активності ферментів здійснювали в безклітинних екстрактах: клітини Acinetobacter sp. В-7005 (1НГ) руйнували ультразвуком (УЗ), одержаний дезінтеграт центрифугували, супернатант використовували як безклітинний екстракт. Для одержання безклітинних екстрактів бактерії вирощували до середини експоненційної фази росту. У разі одержання безклітинних екстрактів Acinetobacter sp. В-7005 культуральну рідину, що містить бактеріальні клітини та ЕПС, попередньо обробляли УЗ (для розщеплення високомолекулярних ЕПС на низькомолекулярні фрагменти), центрифугували, осад клітин тричі відмивали від залишків середовища та ЕПС і здійснювали ті ж самі операції, як і для штаму В-7005 (1НГ).

Активність алкогольдегідрогенази (КФ 1.1.1.1) та ацетальдегіддегідрогенази (КФ 1.2.1.3 і КФ 1.2.1.4), аконітатгідратази (КФ 4.2.1.3), ізоцитратдегідрогенази (КФ 1.1.1.41), малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.37), ізоцитратдегідрогенази (КФ 1.1.1.42), малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.82), 2-оксоглутаратдегідрогенази (КФ 1.2.4.2), оксалоацетатдекарбоксилази (КФ 4.1.1.3), глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.4), глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.2), малатдегідрогенази (декарбоксилювальної) (КФ 1.1.1.38 та КФ 1.1.1.40), фосфоенолпіруваткарбоксикінази (КФ 4.1.1.49) визначали за реакцією окиснення/відновлення НАД(Ф)Н/НАД(Ф)+, відповідно, при 340 нм. Активність алкогольдегідрогенази (КФ 1.1.99.8), сукцинатдегідрогенази (КФ 1.3.99.1) встановлювали за відновленням дихлорфеноліндофенолу в присутності феназинметасульфату при 600 нм. Активність ацетальдегіддегідрогенази ацилювальної (КФ 1.2.1.10), ацетил-КоА-синтетази (КФ 6.2.1.1) та ацетаткінази аналізували за утворенням ацетил-КоА та ацетилфосфату, що утворюють з гідроксиламіном ацетилгідроксамат. Продукт реакції ацетилгідроксамату з хлорним залізом визначали спектрофотометрично при 540 нм. Активність ізоцитратліази (КФ 4.1.3.1) встановлювали за швидкістю утворення, а малатсинтази (КФ 4.1.3.2) – за швидкістю поглинання фенілгідразону гліоксилату при 324 нм. Активність цитратсинтази (КФ 4.1.3.7) визначали за зниженням концентрації ацетилфосфату в присутності коензиму А та оксалоацетату. Активність фумарази (КФ 4.2.1.2) аналізували за утворенням фумарату при 250 нм. Активність піруваткарбоксилази (КФ 6.4.1.1) визначали за швидкістю утворення оксалоацетату і окисненням НАДН при 340 нм у спряженій реакції з малатдегідрогеназою. Активність фосфоенолпіруватсинтетази (КФ 2.7.9.2) встановлювали за зниженням концентрації пірувату в реакційній суміші (реакція з 2,4-динітрофенілгідразином) при 445 нм.

Визначення швидкості окиснення субстратів інтактними клітинами. Швидкість окиснення субстратів інтактними клітинами Acinetobacter sp. В-7005 (1НГ) встановлювали за швидкістю поглинання кисню у реакційній суміші полярографічним методом за допомогою електроду закритого типу на полярографі ППТ-1.

Loading...

 
 

Цікаве