WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Післяопераційна лапароскопія в діагностиці та динамічний лапароскопічний адгезіолізис в лікуванні спайкової хвороби - Реферат

Післяопераційна лапароскопія в діагностиці та динамічний лапароскопічний адгезіолізис в лікуванні спайкової хвороби - Реферат

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані підкреслюють важливість і визначають необхідність обліку вихідного морфофункціонального стану КМ, зокрема, при розвитку в організмі АІЗ, оптимізації методів його кріоконсервування і підвищення ефективності застосування при аутотрансплантації. Роль окремих факторів кріоконсервування (осмолярність і рН) у зміні структурно-функціонального стану клітин КМ тварин з АІЗ може бути врахована при аналізі механізмів ушкодження мієлокаріоцитів і „адаптації" визначених режимів кріоконсервування у відношенні КМ зі зміненим структурно-функціональним станом. Установлений факт „керування" функціонального потенціалу кровотворних клітин КМ різного ступеня диференціювання тварин з АІЗ варіюванням умов кріоконсервування відкриває можливість у клінічній практиці „регулювати" темп відновлення лімфогемопоезу реципієнтів у посттрансплантаційний період.

Особистий внесок дисертанта. Винесені на захист положення і результати отримані дисертантом особисто. Роботи, що відносяться до теми дисертаційної роботи, опубліковані у співавторстві з науковим керівником теми член-кор. НАН України Гольцевим А.М. та іншими співробітниками відділу кріопатофізіології, відбивають результати загального планування і проведення експериментів, узагальнення результатів і підготовки матеріалів до друку. В опублікованих із співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

- у роботах [1, 5, 7] в участі у теоретичній та практичній розробці методів вивчення стану органів ЛГПС, зокрема, клітин КМ при розвитку АІЗ;

- у роботах [2, 8, 9, 11] у вивченні змін життєздатності, адгезивної здатності та фагоцитарної активності клітин КМ тварин з АІЗ після експозиції їх у розчинах різної осмолярності та рН;

- у роботах [3, 4, 12, 13] у відпрацюванні методики культивування нативних та кріоконсервованих клітин КМ щурів з АА та ЕАЕ;

- у роботах [3, 4, 10, 12, 13] у проведенні різних режимів заморожування клітин КМ;

- у роботах [6, 14] у здійсненні визначення активності ферментів антиоксидантної системи та рівня гідроперекисів ліпідів у гомогенатах печінки щурів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на наукових форумах: конференції молодих учених ІПКіК НАН України „Холод у біології і медицині" (Харків, 2003 і 2004 рр.); науково-практичній конференції „Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія" (Харків, 2003 р.); Міжнародному конгресі з кріобіології і кріомедицини „Cryobiomol-2003" (Коімбра, 2003 р.); конференції молодих учених і студентів з молекулярної біології та генетики „50 years of the double helix of the DNA and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine" (Київ, 2003 р.); науково-практичній конференції „Сучасні аспекти репродуктології, перинатальної медицини та кріобіології" (Харків, 2003 р.), Міжнародному конгресі з кріобіології і кріомедицини „The 41stAnnual Meeting of the Society for Cryobiology - CRYO-2004" (Пекін, 2004 р.); I Українській науковій конференції „Проблеми медичної і біологічної фізики" (Харків, 2004 р.); VIII Міжнародній науковій екологічній конференції „Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем" (Белгород, 2004 р.).

Публікації. За матеріалами дисертаційного дослідження опубліковано 14 робіт, з яких 5 - у спеціалізованих фахових виданнях та 1 патент на винахід.

Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 179 сторінках друкованого тексту, з яких 131 сторінка основного змісту. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, заключної частини, висновків, переліку використаних джерел літератури (23 сторінки), що включає 209 першоджерел. Дисертацію ілюстровано 12 таблицями та 44 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Дослідження були виконані на білих 5-6 - місячних щурах-самцях масою 160-180 г (116 тварин) і статевозрілих мишах-самцях лінії СВА масою 19-22 г (120 тварин), що утримувалися в стандартних умовах віварію Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. Усі маніпуляції з тваринами здійснювали згідно з положенням "Європейської конвенції захисту хребетних тварин, які використовуються з експериментальною та іншою науковою метою" (м.Страсбург, 1985 р.).

Індукцію АА здійснювали субплантарним уведенням 0,2 мл повного ад'юванту Фрейнда, що містить 3 мг/мл Micobacterium tuberculosis, на 100 г маси тварини за методом Пірсона [Pearson C.M., 1963]. ЕАЕ індукували уведенням у подушечки чотирьох лап щурів 0,4 мл гомогенату алогенної тканини спинного мозку в суміші з повним ад'ювантом Фрейнда [Давыдова Г.С., 1969]. Контролем була група здорових тварин.

Стан лімфогемпоетичної системи (ЛГПС) тварин оцінювали на 7, 14, 21 і 28-у добу після індукції патології з використанням гематологічних, імунологічних, біохімічних, морфологічних, гістологічних методів і культивування клітин КМ у системах in vitro та in vivo. Зокрема, за допомогою ФІТЦ-мічених моноклональних антитіл (Galtag, США) до CD-4 і CD-8 структур мембран [Шторх В., 1987] було визначено субпопуляційний склад Т-клітин та імунорегуляторний індекс (ІРІ), що виражає відношення CD-4+/CD-8+. Активність природних кілерів (ПК) спленоцитів щурів визначали обчисленням індексу цитотоксичності [Мельников О.Ф., 1999], рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) у сироватці крові - загальноприйнятим методом [Стручков П.В. и др., 1985]. Рівень метаболізму тварин у динаміці розвитку АІЗ оцінювали за вмістом гідроперекисів ліпідів (ГПЛ) у тесті з 2-тіобарбітуровою кислотою [Mihara M. еt al., 1980]; глутатіонпероксидазну (ГПО) і глутатіонредуктазну (ГР) активності реєстрували флуориметричним методом на основі зменшення НАДФН2 [Zakowski J.J., 1978; Лемешко В.В., 1987].

На підставі проведених досліджень було визначено початок хронічного перебігу даних патологій: для АА - 14-у добу, а для ЕАЕ – 21-у добу. Установлення імунологічних ознак, що змінюються найбільш маніфестно у цей період (зниження ІРІ та константи ЦІК), було підставою для вибору часу забору КМ, що одержували зі стегнових кісток шляхом вимивання середовищем 199 з додаванням 10%-ї ембріональної телячої сироватки і 2%-го цитрату натрію.

Розчини з різними осмолярностями (100, 150, 200, 600, 1200, 2400 мОсм/кг) і рН (5,0; 6,0; 8,0; 9,0) були обрані як окремі фактори, що модифікують морфофункціональний стан клітин КМ на етапах кріоконсервування.

На етапі еквілібрації і вибору кріопротектора використовували гліцерин і диметилсульфоксид (ДМСО) у 5, 7, 10 і 15%-й (кінцевій) концентрації. Експозиція клітин КМ із кріопротекторами проводилася при температурі 4°С протягом 10 хвилин - часу, необхідного для оптимального насичення клітин кріопротекторомХолодный В.С., 2002. Проведені дослідження показали, що гліцерин у всіх вищевказаних концентраціях і 15%-й ДМСО негативно впливали на клітини КМ. У зв'язку з цим у подальших експериментах з оцінки впливу різних швидкостей охолодження на морфофункціональну збереженість мієлокаріоцитів були використані 5, 7 і 10%-ї концентрації ДМСО. Кріоконсервування суспензії КМ здійснювали на програмному заморожувачі "Cryoson" (Німеччина) у кріоконтейнерах фірми Nunc обсягом 1 мл (6,0х106 кл/мл).

У роботі апробувані програми кріоконсервування зі швидкостями охолодження:

  • 1 єС/хв до -40°С з наступним зануренням у рідкий азот – режим 1 [Rowley S.D., 1994];

  • 10 єС/хв, 10- хвилинна витримка при температурі -40 С з наступним зануренням у рідкий азот - режим 2 [Останков М.В., 2001];

  • 40 єС/хв, 10- хвилинна витримка при температурі -40С з наступним зануренням у рідкий азот - режим 3 [Козлова Ю.А. и др., 2004].

Відігрівання суспензії проводили на водяній бані при температурі 38-40°С протягом 40-50 с. Після кріоконсервування клітини КМ відмивали від кріопротектора шляхом повільного додавання рівного обсягу робочого розчину і наступного центрифугування.

До і після кріоконсервування оцінювали: життєздатність клітин КМ методом суправітального фарбування 0,2%-м розчином трипанового синього [Костенко Е.А., 1968]; якісний склад ядровмісних клітин на мазках, пофарбованих азур-II-еозином; адгезивну здатність клітин КМ [Пастер Е.У и др., 1989]; фагоцитарну активність (фагоцитарний індекс (ФІ) - відсоток клітин, які фагоцитували;фагоцитарне число (ФЧ) - число захоплених однією клітиною мікроорганізмів; абсолютний показник фагоцитарної активності мієлокаріоцитів - АПФАМ, що визначався за формулою: АПФАМ=ФИхФЧх(абс. кількість кл/мкл суспензії х106)) [Александров М.Г., 1988]. Вміст кровотворних попередників грануломоноцитопоезу (КУО-ГМ) оцінювали за методом С.І. Шерешкова, 1974, у нативному КМ на 7-му добу, у кріоконсервованому – на 14-ту добу культивування з урахуванням факту тимчасової інгібіції проліферативної активності КУО-ГМ після кріоконсервування [Дубрава Т.Г., 1986]. Інтегральний показник КУО-ГМ - це сумарна кількість попередників, що формують структури, до 20 клітин - кластери і більш 20 клітин – колонії [Афанасьев Б.Н. и др., 1985]. Для оцінки розподілу в КМ кровотворних клітин з різним ступенем потентності (менш диференційовані попередники формують колонії, більш диференційовані – кластери [Афанасьев Б.В. и др., 1985]) був введений індекс проліферативної активності (ІПА КУО-ГМ), що представляє собою відношення колонієутворюючих попередників до кластероутворюючих [Гольцев А.Н. и др., 2005]. Кровотворні попередники, що формують колонії в селезінках летально опромінених мишей (КУОс), визначали загальноприйнятим методом [Till J.E., 1961] на 8-у добу – КУОс-8 (більш диференційовані) і 14-у добу – КУОс-14 (менш диференційовані) [Harris R.A. et al., 1984] після введення КМ. Вміст колоній різних типів у селезінках оцінювали на гістологічних зрізах [Меркулов Г.А., 1961].

Loading...

 
 

Цікаве