WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Роль ендотеліальної дисфункції в патогенезі гломерулонефриту (експериментально-клінічне дослідження) (автореферат) - Реферат

Роль ендотеліальної дисфункції в патогенезі гломерулонефриту (експериментально-клінічне дослідження) (автореферат) - Реферат

Отже, спустошення ЕР активує вхід Са2+ ззовні, незалежно від способу спустошення (InsP3-залежного чи -незалежного), а рівень входу Са2+ прямо визначається ступенем спустошення депо.

8. Роль мітохондрій у регуляції депо-керованого входу Ca2+

Функціонування [Ca2+]i-транспортних систем мітохондрій у стані спокою. Для з'ясування ролі Са2+-уніпортеру МХ у підтриманні базального рівня [Ca2+]i використовували роз'єднувач протонного градієнту на мембрані МХ карбоніл ціанід м-хлорфенілгідразон (СCCP). СССР (10 мкмоль/л) викликав підвищення [Ca2+]i на 50  6,7 нмоль/л (n=8) у кальцієвмісному розчині і на 37  4 нмоль/л (n=5) – у безкальцієвому (рис.9). Для підтвердження того, що така зміна [Ca2+]і обумовлена блокуванням Ca2+-уніпортеру МХ, а не пригніченням роботи Ca2+-АТФаз у результаті припинення МХ синтезу АТФ, використали ротенон (інгібітор комплексу І ланцюга транспорту електронів) та олігоміцин (інгібітор АТФ-синтази), що запобігає активації реверсивного режиму роботи АТФ-синтази (Nicholls &Budd, 2000). Оскільки ефект 10 мкмоль/л ротенону та 1 мкмоль/л олігоміцину не відрізнявся від викликаного СССР, отже, підвищення [Ca2+]i опосередковане блокуванням Са2+-уніпортеру та вивільненням Са2+ з МХ.

Основним шляхом транспорту Са2+ з МХ є його виведення Na+/Ca2+-обмінником (Badcock &Hille, 1998). Виявилось, що блокування Na+/Ca2+-обмінника МХ селективним блокатором – CGP 37157 (20 мкмоль/л) не супроводжувалось змінами [Ca2+]i (n=5). Змін [Ca2+]i не виявлено також при одночасному прикладанні СССР і СGP 37157, що є свідченням того, що у спокої клітин є неактивною мітохондріальна пора проникного переміщення (permeability transition pore), яку вважають додатковим механізмом виведення Ca2+ з матриксу МХ (Zoratti &Szabo, 1995).

Модуляція мітохондріями депо-керованого входу Са2+. За умови блокування акумуляції Са2+ мітохондріями виявлено пригнічення депо-керованого входу Са2+ щонайменше вдвічі та сповільнення його кінетики, як у випадку тапсигаргін-індукованого, так і агоніст-опосередкованого спустошення ЕР (табл.4). Зокрема, на фоні СССР амплітуда депо-керованого підвищення [Ca2+]i при спустошенні ЕР тапсигаргіном зменшувалась на 51 15 % (p<0,01; n=5, рис. 10), АХ – на 73 12 %.

При дослідженні ролі транс-мітохондріального транспорту Са2+ у регуляції його входу ззовні виявлено подібне зменшення рівня депо-керованого входу Ca2+ на фоні CGP 37157. При цьому зменшувалась лише амплітуда [Ca2+]i-транзиєнту (на 53 11 % (p<0,01)), тоді як час напівзростання достовірно не змінювався (табл.4, рис.11). Очевидно, пригнічення входу Са2+ при дії CGP 37157 не опосередковане зменшенням кількості відкритих SOC-каналів ПМ, а обумовлено припиненням виведення Са2+ з МХ, що супроводжується відповідно пригніченням акумуляції Ca2+ МХ і як наслідок – підвищенням [Ca2+]i, яке, в свою чергу, призводить до Са2+-залежної інактивації SOC-каналів ПМ.

Отже, МХ належить важлива фізіологічна роль у підтриманні депо-керованого входу Са2+ в ацинарні клітини підщелепної слинної залози.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Аналіз результатів дослідження параметрів слиновиділення при активації холінорецепторів invivo та вмісту кальцію invitro дозволяє зробити висновок про те, що секреторна активність ацинарних клітин підщелепної слинної залози опосередкована змінами внутрішньоклітинного гомеостазу кальцію, що цілком узгоджується із даними літератури (Abe et al., 1987; Putney, 1986; Liu et al., 1998; Ambudkar, 2000). Про кальцієву залежність секреції слини свідчить як зростання концентрації Са2+ у слині при холінергічній стимуляції тварин invivo, так і підвищення сумарного вмісту кальцію у клітинах при інкубуванні їх invitro з агоністами М-холінорецепторів. Виявлене нами виведення Са2+ разом із вмістом секреторних гранул є важливим компонентом стимульованої секреції і, очевидно, служить для більш швидкого відновлення [Са2+]і після завершення дії стимулу, що показано й іншими авторами (Gerasimenko et al., 1996; Martinez et al., 1996).

Основним механізмом підвищення [Ca2+]і для запуску секреції ацинарними клітинами є вивільнення Са2+ з ЕР, механізми якого остаточно нез'ясовані. Для дослідження перебігу та регуляції вивільнення Са2+ з ЕР ми розробили методичний підхід для прямої реєстрації зміни [Ca2+]ЕР. Падіння флуоресцентного сигналу маг-фура 2/АМ при пермеабілізації клітин детергентами (дигітоніном та β-есцином) свідчить про опроникнення ПМ, тоді як підвищення [Са2+]ЕР при наступній перфузії клітин АТФ-вмісним НДВ-розчином підтверджує інтактність мембрани ЕР. Більше того, зареєстрований [Ca2+]ЕР-транзиєнт при аплікації АХ до β-есцин-пермеабілізованих клітин свідчить про цілісність рецептор-зв'язаних сигнальних механізмів при пермеабілізації, що показано і на пермеабілізованих панкреацитах (Lomax et al., 2000).

У секреторних клітинах основним депо Са2+ є ЕР (Ambudkar, 2000; Berridge, 2002), проте, здатністю депонувати та вивільняти Ca2+ характеризуються також секреторні гранули, МХ (Martinez et al., 1996), ядро (Gerasimenko et al., 1995) і апарат Гольджі (Pinton et al., 1998). Виявлене нами функціонування в ацинарних клітинах тапсигаргін-нечутливого іономіцин-чутливого немітохондріального депо Са2+ є фізіологічно доцільним, оскільки Са2+, локалізований в інших субклітинних компонентах секреторного шляху, зокрема, апараті Гольджі, як і Са2+ в ЕР, відіграє важливу роль у трансляції, транслокації та процессінгу секреторних білків (Lodish et al., 1992). Враховуючи це, ми припускаємо, що InsP3-чутливе депо Са2+ наявне в апараті Гольджі.

Шляхом реєстрації [Ca2+]ЕР нами показано, що АХ- та ІnsР3-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР опосередковується тільки ІnsР3-рецепторами. На основі цього ми вважаємо, що холінергічна стимуляція слиновиділення invivo пов'язана виключно із активацією ІnsР3-рецепторів, а опосередковане ними вивільнення Са2+ з ЕР є основним механізмом запуску секреції рідкої слини. Таке ІnsР3-індуковане вивільнення Са2+ потенціюється цитозольним Са2+ (100-400 нмоль/л), що зумовлено, очевидно, зростанням ймовірності перебування ІnsР3-каналів у відкритому стані (Iino, 1990). АТФ також характеризується біфазним впливом на ІnsР3-рецептор, оскільки у високих концентраціях АТФ, як і кофеїн, є конкурентним антагоністом ІnsР3-зв'язуючого центру рецептора (Bezprozvanny &Ehrlich, 1993).

Ми довели наявність в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози функціонально-активних ріанодинових рецепторів (RyR), участь яких у [Cа2+]і-сигналізації залишалась нез'ясованою. Зареєстроване кофеїн-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР було транзиєнтного характеру, а його амплітуда залежала від [Cа2+]і. Ріанодин (100 мкмоль/л) блокував вивільнення Ca2+, а у концентрації 10 мкмоль/л – фіксував канал у відкритому стані, що є класичними характеристиками RyR (Buck et al., 1992). З іншого боку, при активації RyR не спостерігається зростання [Cа2+]і в інтактних клітинах, що ми пов'язуємо із швидким захопленням Са2+ мітохондріями, близька локалізація яких з ЕР виявлена електронно-мікроскопічно. Ґрунтуючись на отриманих даних, ми припускаємо скоординовану участь кількох Са2+-транспортних систем у формуванні кофеїн-індукованого [Cа2+]і-сигналу (рис.12): кофеїн активує RyR → Са2+, що вивільняється, захоплюється МХ → виведення кальцію Na+/Са2+-обмінником МХ починає переважати над процесом його захоплення Са2+-уніпортером і МХ звільняються від накопиченого Са2+ → активуються Са2+-АТФази ПМ та ЕР, які підтримують низьку [Са2+]і.

За відсутності стимуляції відбувається базальний витік Са2+ з ЕР, який можна візуалізувати шляхом блокування Са2+-АТФази ЕР (Hofer et al., 1996). Виявлене нами зменшення [Ca2+]ЕР у безкальцієвому НДВ-розчині та при дії тапсигаргіну доводить наявність пасивного витоку Са2+ в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. Такий витік Са2+ з ЕР потенціюється пуроміцином і блокується анізоміцином, а, отже, здійснюється через пору транслоконового комплексу, участь якої у забезпеченні пасивного витоку Са2+ з ЕР показано на панкреацитах (Lomax et al., 2000).

Основним шляхом перезаповнення депо кальцієм після стимуляції клітин є вхід Са2+ через депо-керовані Са2+-канали ПМ та наступний транспорт всередину ЕР Са2+-АТФазою (Putney, 1986; Ambudkar, 2000; Shuttleworth, 2004), однак механізми активації та регуляції такого входу остаточно нез'ясовані. Припускають існування кількох типів SOC-каналів, які відрізняються способами активації (без зміни ІnsР3 та за участі ІnsР3-каналів), з іншого боку, не виключають і можливості активації одного типу SOC-каналу різними шляхами (Ambudkar et al., 1992; Liu et al., 1998, 2000). На основі кількісної оцінки амплітуди та кінетики депо-керованого підвищення [Ca2+]i ми дійшли висновку, що вхід Са2+ в ацинарні клітини активується незалежно від способу спустошення ЕР (InsP3-залежного чи -незалежного), а однакова кінетика розвитку депо-керованого [Ca2+]i-транзиєнту може свідчити про єдиний механізм його активації.

Loading...

 
 

Цікаве